第28章 基因诊断与基因治疗(袁野).ppt

基因诊断与基因治疗Gene Diagnosis and Gene Therapy;第一节 基因诊断学基础 第二节 遗传病的基因诊断 第三节 传染病的基因诊断 第四节 肿瘤的基因诊断 第五节 基因诊断在法医学上的应用 第六节 基因治疗的概念及策略;第一节  基因诊断学基础Basis of Gene Diagnostics;基因诊断之父—简悦威;一、基因诊断的概念、特点及临床意义 ;诊断依据(遗传物质改变) DNA、RNA或蛋白质水平变化，如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高； 基因结构变化，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活。;基因诊断的特点 高特异性 高灵敏性 早期诊断性 应用广泛性;（一）核酸分子杂交 Nucleic acid hybridization;核酸分子杂交流程; 提取DNA→限制性内切酶消化DNA以产生特定长度的片段→凝胶电泳分离 →变性处理→DNA转印到膜上并使其牢固结合→将标记的探针与膜上DNA片段杂交，分析杂交信号。; RNA经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移到固相支持物上，通过分子杂交检测特定的mRNA分子的含量与大小。;3. 斑点杂交（dot blotting）; 4. 反向斑点杂交（reverse dot blotting）; 寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，可用人工合成的针对正常和突变ASO探针进行反向斑点杂交，检测点突变，大大提高检测结果的可靠性。;5. 原位分子杂交;荧光原位杂交（FISH）; 6. 固相夹心杂交法(sandwich hybridization);;（二） 聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR）;PCR在基因诊断中的应用;1. RT-PCR;2. 荧光定量PCR; 3. 多重PCR;;（三）单链构象多态性分析（single-strand conformation polymorphism, SSCP）;PCR-SSCP分析原理示意;正常人; （四）限制性片段长度多态性分析 （restriction fragment length polymorphism, RFLP）; 设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列，在PCR扩增后用该限制酶切割PCR产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。;;（五） DNA序列测定（DNA sequencing）;DNA序列测定原理(双脱氧末端终止法);左侧：正常；右侧突变 ;（六）生物芯片（biochips）;基因芯片杂交流程示意图;基因诊断中常用的分子生物学方法比较;三、 基因诊断技术路线与方法;（一）直接诊断途径;5/—;斑点杂交、反向斑点杂交 AS-PCR、PCR-SSCP、 PCR-ASO、 PCR产物直接测序; 在DNA序列上有一段较长序列的重新排布。包括数十个碱基到数千个碱基的丢失、插入、替换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等。 ;; 根据引物3′端的互补与否，设计一对与正常或突变模板配对的特异引物;3. 基因表达异常的检测 mRNA的相对定量分析 mRNA的绝对定量分析 mRNA长度分析;（二）间接诊断途径; DNA多态性：指群体中的DNA分子存在至少两种不同的类型，即个体间同一染色体的相同位置上核苷酸序列存在一定的差异或变异。 多在进化中形成，本身并不致病，只是与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。;间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记;; 第二节  遗传病的基因诊断Gene Diagnosis of Hereditary Diseases;一、血红蛋白病（hemoglobinopathy） （一）镰状细胞贫血病 （二）β-珠蛋白生成障碍性贫血症 二、血友病（Hemophilia） 甲型血友病基因诊断 三、脆性X综合征 ;（一）镰状细胞贫血病;正常的（N）的ASO探针： 5′-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3′ 突变的（M）的ASO探针： 5′-ACT CCT GTG GAG GAAG TCT GC-3′ ;斑点杂交结果 N：正常；M突变;;;3. HBS的PCR-RFLP分析 ;1. PCR-RFLP分析 ;?-珠蛋白生成障碍性贫血症的反向斑点杂交分