鹅细小病毒主要结构蛋白基因的克隆、测序及载体的构建.pdfVIP

主垦童塑璺匡兰垒童复芏量叁墨±选芏墨壁过鱼焦塞整 鹅细小病毒主要结构蛋白基因的克隆、 测序及载体的构建1 马 君 章金刚。 向 华 李雪梅史秋梅 宣 华 (解放军军需大学动物科技系．长春130062) B株)基因组棱昔酸序列设计并 parvovirus．GPV)B株(GPV 擅耍根据zadori等发表的鹅细小病毒(goose 获得的PcR产物与璜期片段大小相符．约1．8kb．将该片段直接克隆进真核表达T载体pcR3．1。经鉴定-证实构 建了含有GPv主要结构蛋白基因的真核表达载体。将该表达载体经双酵切后，定向克隆进pET一28b(+)·经鉴定 证实为古有目的基因的原核表达载体(pG)，为高效原菝表达以及研制更为有效的基因工程疫苗打下了基础。(序列 cc株与GPvB株的主要结构蛋白基因具有98．9％的核苷酸序列同源性·PcR—RFLP结果也显 分析表明．GPv cc株比GPVB株多一个 示，这两株病毒的主要结构蛋白基因B西I．EcoRI，Hindl，scaI等酶切谱带相同·GPV P5tI酵切带t关-调粤和小病毒主要结构蛋白基因序列分析载体构建 鹅细小病毒病是引起雏鹅高度致死的一种传染病，目前在亚洲和欧洲均有流行的报道。““。我国 学者方定一于1956年在扬州最早发现该病并分离出病毒”。，将该病命名为小鹅瘟，国外称为Derzsy disease。鹅细小病毒(GPv)为细小病毒科细小病毒属禽细小病毒成员“。，无囊膜。基因组为单股、 线状DNA，含有两个主要开放阅读框架(ORF)”。，并且这两个开放阅读框架位于同一个读码框中。左 构蛋白，即病毒的保护性抗原，约占总蛋白的80蹦，这两种结构蛋白多肽之间可能存在相同的抗原决 定簇；vP3是VP2的降解产物，暴露于衣壳蛋白表面，它只在衣壳装配和病毒基因组包装后才出现， 其相对量随着感染进程的发展而增加。VPl基因在衣壳形成过程中可能是非必需区。本研究克隆了 GPv主要结构蛋白vP2、vP3基因，构建了含有该段基因的真核和原核表达载体，为进一步研究该 病毒的分子生物学特性以及研制更为有效的基因工程疫苗打下了良好的基础。 l材料与方法 1．1 GPv cc株及其抗血清由吉林省兽医研究所潘玉民研究员惠赠。 1．2质粒及菌种线性pcR3．1 军需大学军事兽医研究所卢强博士提供．DH5a为解放军军需大学军事兽医研究所刘维全博士提供。 1．3病毒增殖及鉴定GPvcc株经适当稀释，尿囊腔接种13日龄的鹅胚，在37℃、相对湿度 60蹦～70％的条件下继续孵化。接毒后24小时内死亡的鹅胚废弃，收取接毒后2～5天死亡的鹅胚 尿囊液，通过电镜观察以及与小鹅瘟抗血清作琼脂扩散试验鉴定后，一20℃保存备用。 1．4 B株全基因组核苷酸序列设计了一对用以扩增 PcR扩增根据zadori等…发表的GPV l国家自然科学基金和教育部回国人员启动基金资助项目 2通讯作者．现单位为军事医学科学院输血医学研究所 史旦童塑璺里芏量蔓塞兰堑叁至上选芏查煎过垒堡皇墓 clmin；72C 变性10min；97C305；48．j 2min，共30个循环，72℃延伸lOmin。 1．5 PcR产物的酶切分析PcR产物分别加风lI、Ec。RI、HindI、PstI、ScaI在2叩I体系进行 酶切。 1．6真核表达载体的构建PcR产物直接克隆进真核表达T载体pcR3．1，转化入感受态大肠杆 PAl—3)，即含有目的基因的真核表达载体，同时也获得2个反向插入的克隆(pVPBl一2)。 析核苷酸序列，并与GPVB株和MDPvFM株比较。 含有目的基因的原核表达载体(pG)。 2结果 2．1病毒增殖及鉴定鹅胚在接毒后2～5天死亡，胚体表现为充血、出血。尿囊膜水肿等病变，收 集尿囊液。电镜观察可见到典型的细小病毒粒子的形态，与GPv抗血清作琼脂扩散试验可见明显