鹅源副粘病毒NA1株F基因定点突变及其在BactoBac系统中的表达.pdfVIP

禽类传染病 鹅源副粘病毒NA．1株F基因定点突变及其在 Bac．to．Bac系统中的表达·1 杜眉，丁壮’．徐明，宋子适，毕玉海，尹仁福 (吉林犬擘预防兽医学国家重点学科动物重岳痛原与疫病研究室，吉林长春130062) 摘 要禄据已发表的鹅源l《粘病毒CGPMy)NA．I株F基因序列设计两对引物．引物中鲁有突变位点． 分三次扩增F基因片段，从而得到目的基圊片段，再利用酶切位点将基因片段与转座栽体口FascBacI连接， 获得重组质粒，命名为pF瞄tB∞I·P，从而使茂造后的F，基因编码的氧基酸裂解位点为“2 捂八到B粒mid质枉申，经蓐选获得的重组B8啪idF’转集s丹昆虫细胞，井进行表迭检测。结果，表达产 物经sDs．PAGE和wesIcm-blot检测获得蛋白特异奈带，相当分子量约63KDa． 美键词鹅源副粘病毒；F基因；定点突变；表速 禽I型副粘病毒病(APMvmI)是严重危害养禽业的传染病之一。传统的理论普遍认为水 禽不能自然感染新城疫，即使感染也只是隐性带毒，不能引起发病。但自1997年以来，在 我国江苏、广东、山东、吉林等省的鹅群中广泛流行一种类似鸡新城疫的传染病，经病原鉴 定为禽I型副粘病毒(APMV—I)，命名此病为鹅源副粘病毒病(GPMVD)，即鹅源新城疫ll…。 在生产实践中以及我们的实验研究结果均表明，利用鹅源副粘病毒强毒苗、灭活苗或是传统 的L硒。诅弱毒疫苗来免疫预防鹅源副粘病毒病起到了积极作用，但其自身也存在不可避免 的缺点，如灭活苗存在某些重要抗原表位丢失的现象，使用传统的新城疫LaSota弱毒疫苗 免疫鹅时易发生毒力返涵等。同时在我国还未见有分离出鹅源副粘病毒弱毒株的报道，因此 要从根本上防治和预防鹅源哥I粘病毒病的发生必须建立和鸡新城疫相似的免疫程序。因此， 解决这一问题迫在睫．今后的研究方向在于研制新的、特别是针对鹅源副枯病毒的高效低毒 的弱毒疫苗。本试验针对鹅源副粘病毒F蛋白的特点，定点突变鹅源副粘病毒NA．1株F蛋 白112、115、117位氨基酸密码子，使改造后的F蛋白的裂解位点具有弱毒株的特点，然后 应用Bac．to．Bac杆状病毒表达系统对改造后的基因进行表达，最后通过SDS．PAGE和 wbsIem．blot试验鉴定表达产物的表达效率和免疫原性。从而为地通过反向遗传技术构建鹅 源副粘病毒NA．1株弱毒株奠定了基础。 1材料与方法 1．1质粒、受体菌、细胞 NA一1株F 大肠杆菌DH5n由本研究室保存，重组质粒p0F(GPMVgene)由本实验室 构建。转座载体pFastBacI、D￡H∞∞宿主菌、昆虫细胞sf9购自Invi仃Dgen公司。 1．2酶与试剂 公司；DNA geI 杉金桥生物技术有限公司：鼠抗GPMV阳性血清由本实验室自制。 1．3PCR反应引物的设计 根据己发表的鹅源副粘病毒NA．1株F基因序列采用PcR体外定点突变技术，首先设 计一对外侧引物F1和F2，该对引物分别与模扳DNA的5。末端、3’末端互补。然后再在突 变处设计一对完全互补的引物F3和F4。互补处引物长度为18bp，设计原则是引物F3和F4 有两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的区域。使用这种重叠PcR定点突变法，需 要进行三轮PcR反应。其中，前两轮扩增形成两条有一端可彼此互补的双链DNA片段，两 者在其重叠区段具有同样的突变，第三轮PcR使这两条片段融合起来，形成完整的目的基 305713乃) ’1基金项茸：图幕自然科学基金资助项日f 作者简介：桂罔(1982一)，女，在读博士生，主要从事畜禽传染病及病毒分子生物学研究 +通讯作者，Di“g．出u明g@yall00．com．cII 中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会 因片段，突变引物如下： Fl：5’．rrAC矗叫眦ATGGGCTCCAAACCTrCl乙3’： F2：5’-1CA，L《GC力TGCTCTT01AGTGGCTC-3’： Fl和F2两引物的s。端分别加上了占coR I和胁硼ⅡI酶切位点(斜体表示)。F3和F4 两引物互补处由下划线标注，突变碱基处由方框标注。 1．4目