鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应克隆毒回归鸡后的致病性与VPlt2gt基因比较.pdfVIP

中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应克隆毒回归鸡后的致病性 与VP：基因比较8 朱瑞良，崔治中‘，赵静，张纪元，丁家波 (山东农业学动物科技学院．泰安，27{018J al den et et (Chtfleet1989，VanBerg1991，Brown and et et et etal 行株VP2的高变区的系谱关系(Linal，1993；Yamaguchial，1997；Caoal，1998；To etal 崔静，1995；Chen 性或其它生物学特性的关系。 在此同时，国内外也先后有人对野毒株适应细胞后再回归鸡，比较不同阶段病毒的VP2可变区，以 此比较研究V巳商变区与毒力的关系。但由于均没有将病毒克隆化，因此研究的对象始终是一个病毒群 体，很难确定不同传代阶段病毒的差异是选择的结果还是突变的结果。为了解决这一问题，本研究先将 细胞适应毒在细胞培养上用无限稀释法克隆化，然后再研究其在回归鸡体传代过程中的变化。 1、材料与方法 1．1 4～5周SPF鸡及商品鸡的致死率可达80～90％(崔治中等，2002)。 1．2 试验总体设计： GX8／99株(囊毒) l SPF鸡胚传代10代 l 鸡胚成纤维细胞(CEF}盲传至出现细胞病变 l 用无限稀释法连续克隆2次 (取数个独立的克隆病毒核酸测序和致病性测定) l 将每个病毒克隆分别回归SPF鸡，用囊毒连续传10代(B1一lO) l e ‘ 将细胞胞适应克隆毒及其回归鸡的 将细胞胞适应克隆毒及其回归鸡的 1、5、10代毒在SPF鸡傲致病性实验 1、5，10代毒傲VP2扩增及DNA测序 ‘ 比较各代次病毒的致病性及其VP2高变区序列 1．3 病毒的鸡胚传代和病毒的定量：按以往的方法进行(崔治中，2002)，分别取鸡胚传代的1代、 5代和10代毒保存备甩。 8本文为国家自然科学基金重大项H助。 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 I．4 病变或检出病毒。 1．5 科院生产的IBDVELISA试纸条检测。 1．6 现病变的那些孔作为克隆病毒。并选择几个克隆孔的上清液分*Ⅱ独立地重复克隆一次。将第二次克隆过 程中选择到的出现细胞病变孔的细胞培养上清液接种含CEF的细胞瓶中，在大量繁殖病毒一代后取上清 液于一70℃保存。取剩余的细胞提取病毒核酸。 1．7 SPF鸡，接种每一病毒克隆的鸡均单独饲养在带正压过滤空气的隔离罩中，以避免不同病毒克隆间的相 互污染。在接种病毒后3天，不论是否发病，均扑杀采集法氏囊。将同一组鸡法氏囊混合制成匀浆后， 周龄SPF鸡做致病性试验，同时分别取回归鸡后1、5、i0代的法氏囊样晶提取核酸用。 1．8 et 不同组织中病毒RNA的提取：VP2高变区及RT—PCR均按Chen 所用的、相关引物。 1．9