高效疏水作用色谱分离纯化棉铃虫中肠微粒体P450.pdfVIP

106 农药与环境安全国际会议论文集 高效疏水作用色谱分离纯化 棉铃虫中肠微粒体P450 郑明奇1 邱立红1 邱星辉2“ 张文吉1 (1中国农业大学应用化学系，农业部农药化学及使用技术重点实验室，北京100094； 2中国科学院动物研究所，农业虫害鼠害综合治理研究国家重点实验室，北京100080) 摘 要本研究对高效疏水作用色谱(HPHIC)分离棉铃虫中肠微粒体P450的条件进行了优 化。HPHIC分离条件为：微粒体P450在50rain内，以0．5mL／min流速，由流动相A2至流动相B nlTI检测。经HPHIC分离后，微粒体P450主要在第Ⅱ组、第Ⅲ组峰 的线性梯度洗脱，馏分在405 中被洗脱出来；P450比含量提高了5．2倍，回收率为39％。 关键词 棉铃虫 细胞色素P450高效疏水作用色谱分离纯化 细胞色素P450(简称P450)是一种普遍存在于生物体中的氧化酶系，在生物内源性物质 的生物合成以及对外源物质的代谢中有着重要作用。大量研究结果证实，多种P450参与了 保幼激素(juvenilehormones)、蜕皮激素(molting 以及赤霉素(gibberellins)等多种动、植物激素的生物合成；因而，参与催化这些激素生物合成 的P450都可能成为创制新农药的重要靶标。P450对杀虫剂、除草剂的代谢作用，是昆虫和杂 草对杀虫剂和除草剂产生抗性(或耐受性)的重要原因；作物和杂草中P450对除草剂代谢能 力的差异是导致除草剂选择性的重要机理。此外，高等动物的P450能使某些农药形成毒性 更高甚至具有致癌作用的代谢物。深入研究P450的催化反应、功能及结构，对于创制新农 药、研究农药抗药性和选择性机理以及农药对高等动物的毒性等具有重要意义。 P450是一类由超基因家族编码的同功酶系。为了研究不同型P450的结构和功能，须通 过一定的分离纯化手段分离出单型P450。目前，尽管已建立起许多针对哺乳动物微粒体 P450的分离纯化方法，但针对昆虫微粒体P450的分离纯化方法较少，有关棉铃虫微粒体 P450的分离纯化未见报道。昆虫微粒体P450分离纯化进展缓慢的主要原因是在纯化技术 上面临许多困难，如P450稳定性差、增溶剂导致P450变性、昆虫P450的总量和比含量低等。 随着高效液相色谱(highperformanceliquid P450的分离纯化提供了许多便利。在此，我们对利用高效疏水作用色谱(highperformancehy— interaction drophobic 1材料与方法 1．1供试棉铃虫及试虫处理 棉铃虫于1988年采自河北邯郸，于室内无药剂接触条件下连续饲养。 基金项目；国家自然科学基金资助项目。 *通讯作者。联系电话：010E-mai：qiuxh@panda．ioz．aC．Oil Ⅱ 农药与环境安全 107 参照Qiu等方法L1J，将五甲基苯按o．2％(W／W)比例拌入一定量的人工饲料中，搅拌均 匀后分装在已灭菌的十孑L盒中，然后挑选整齐一致、刚进入5龄的幼虫，饲养48 h，取中肠提取 微粒体P450。 1．2药剂 子量蛋白质标准(Pharmacia公司)，Emulgen911(美国Karlan研究所)。 1．3棉铃虫中肠微粒体P450酶液的制备 参照Qiu等方法Ll|，在蜡盘上纵向解剖棉铃虫取出中肠，去除内容物后置于冰冷的匀浆 缓冲液(pH7．5的0．1mol／L磷酸钠缓冲液中含1mmol／LEDTA、0．1mmol／LDTT、 1 mmol／L mmol／LPTU、1PMSF和质量分数为10％的甘油)中漂洗，然后置于电动玻璃匀浆 器中并加入适量的匀浆缓冲液匀浆；匀浆液于10000×g离心15min，上清液经两层纱布过滤 后于105000×g离心60min，沉淀用重悬浮缓冲液(pH7．5的0．1 mol／L磷酸钠缓冲液中含 1