具有群体感应抑制活性的海洋细菌的筛选与活性物质研究Screening of marine bacteria with population induced inhibition activity and Study on active substances.pdfVIP

具有群体感应抑制活性的海洋细菌的筛选 与活性物质研究 摘要 细菌耐药性问题日趋严重，传统的抗菌药物容易使病原菌产生抗药性，要从根本上 去除细菌的致病性还是要通过阻断或改变其致病过程中必须的通路，使致病基因无法表 达，这样不仅消除了细菌的致病性，还确保了不会产生耐药性问题。群体感应调节着细 菌诸多生理功能，而大多数细菌的致病性亦受到细菌群体感应系统的调节，通过研究细 菌的群体感应体系，建立科学的筛选模型，找到具有抑制细菌群体感应活性的天然产 物，是开发新型抗菌物质的有效途径。 本论文以紫色杆菌12472为报告菌，对从美国圣璜岛海域海绵中分离出的272株细菌 进行群体感应活性的筛选，获得2株能有效抑制紫色杆菌12472群体感应活性的菌株66 验；然后对108号菌发酵条件和培养基组成作了优化，通过活性测试确定其最佳发酵条件 和培养基组成；采用优化后的培养条件对菌株108进行扩大培养，活性物质的粗分离，用 薄层层析法确定了活性物质的柱分离条件，对108号菌的发酵产物进行反相减压柱分离， 通过高效液相色谱法、核磁共振波谱法和GC．MS质谱法鉴定了活性物质的化学组成，为 天然产物作为群体感应抑制剂的研究提供了参考。主要结论如下： (1)运用滤纸片法，双层软琼脂法和色素抑制法对分离自美国圣璜岛海域海绵中的 272株海洋细菌进行了群体感应抑制活性的筛选。结果表明，经过多次滤纸片法重复实验， 有17株菌群体感应活性较好，能有效抑制紫色杆菌12472群体感应活性，其中66，74， 108，552等菌效果较好，抑制半径始终在2mm左右；经过双层软琼脂法实验，证实有40 株菌活性较好，其中大多数都是在滤纸片法中有较好活性的菌株；通过色素抑制法的筛选， 发现108号菌株抑制效果最明显，与空白对照相比较，抑制率达到20％左右。综合各个方 法筛选结果，选取66和108号菌株进行菌种鉴定，并对108号菌进行进一步实验。 66与表皮短杆菌(BrevibacteriumSW34)亲缘关系最近，108与马胃葡萄球菌 epidermidis (Staphylococcusequorumsubsps)亲缘关系最近。 (3)通过单因子实验，对活性菌108的发酵条件进行优化。考察不同发酵时间、温 度、转速、接种量、pH和培养基组成对菌株生长、代谢物产量、群体感应抑制活性的影响。 结果表明：108号菌株最佳发酵条件为发酵时间36h，发酵温度25℃，转速120 rpm，接 7；最佳培养基组成为蛋白胨15 15 种量5％，培养基pH g／L，酵母膏5g／L，NaClg／L。 (4)采用优化的培养条件对菌株108进行规模化培养，培养体积为45L，经乙酸乙 酯．丙酮萃取后，得到粗提物2．9g。将108的发酵产物初步分成极性不同的三相：正己烷 相、二氯甲烷相和甲醇水相，运用滤纸片法进行活性测试。结果显示，活性组分主要集中 于二氯甲烷相中。采用薄层层析法选择分离108号菌活性产物的溶剂体系、溶剂比例及代 谢物质大致的极性段。结果表明，丙酮和石油醚体系适于108二氯甲烷相的分离。用反相 的梯度洗脱，对洗脱下的物质进行活性追踪，发现60％甲醇水洗脱下的物质具有最强的群 体感应抑制活性，在250 nllil。 rtg／片的用量下，活性物质对紫色杆菌素的抑制圈半径达到7 高效液相色谱面积归一化法结果显示，活性产物含量为15．962％。核磁共振波谱(混合氢 谱)和GC．MS质谱初步分析结果，活性成分主要为环(脯氨酸一亮氨酸)。 关键词：紫色杆菌；群体感应抑制活性；分离筛选；活性物质；鉴定 forthe from Screen sensinginhibitoryactivity