南开大学仪器分析课件-第十二章 高效液相色谱分析法.pptVIP

第十二章 高效液相色谱分析法  (High Performance Liquid Chromatography, HPLC ） 第一节 概述 一、HPLC的特点 1、 高压：液相色谱法使用液体作为流动相(简称载液)，液体流过色谱柱时，所遇到的阻力很大，为了使载液迅速通过色谱柱，必须对载液施加高压150-350×105 Pa。 2、 高速：高效液相色谱法的分析时间较经典的液相色谱所需的时间要少得多，分离一个样品只需几分钟至几十分钟，仅为经典液相色谱的几十分之一。 3、 高效：一般气相色谱法的塔板数是数千塔板／米，高效液相色谱法的塔板数可达约3万塔板/米，使分离效率大大提高。 4、 高灵敏度:紫外光度检测器的检测限可达10－9g，荧光检测器的灵敏度可达10－11g 。 二. HPLC与GC的比较 1. 分析对象不同 GC: 20%有机物总数(气体、沸点较低 的、 热稳定的化合物） HPLC：80%有机物总数（高沸点、热稳定性差） 2. 流动相不同 GC：仅起运载作用 HPLC：除具有运载作用外, 还与组分产生亲和力（增加 了一个控制和改进分离条件的参数） 3. 操作条件不同 GC：较高温度 HPLC：室温下进行（设备费用高） 第二节 HPLC的理论基础 一、范第姆特方程式：H = A + B/u + C·u 1. 涡流扩散项－A 2. 纵向扩散项（B/u) B/u= 2γDm / u γ— 弯曲因子 Dm — 组分分子在流动相中的扩散系数 Dm很小，只要流速u不是太低（不小于0.5cm/s ）， B/u项可忽略 3. 传质阻力项 液—液分配色谱 Cu= Cmu + Csu Cmu — 流动相传质阻力项 Csu — 固定相传质阻力项 Cmu=(ωmdp2/Dm + ωsmdp2/Dm ）u （包含流动的流动相中的传质阻力和滞留的流动相中的传质阻力） Dm — 组分在流动相中的扩散系数 ωm — 柱和填充性质决定的因子（柱系数） ωsm —与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量 因子有关。 dp — 固定相粒度 Csu= (ωsdf 2/ Ds ) u Ds — 组分在固定相（液）的扩散系数 ωs — 与容量因子k有关的系数 df — 固定相液膜的厚度 综合式： H= 2λdp+ 2γDm / u + (ωmdp2/Dm + ωsmdp2/Dm +ωsdf2/Ds ）u 第三节 高效液相色谱仪 贮液罐 高压泵 进样器 液相色谱仪（1） 液相色谱仪（2） 液相色谱仪（3） 液相色谱仪（4） 一、高压输液系统 1. 贮液罐: 用来贮存作为流动相的各种溶剂 2. 高压输液泵（核心）：使流动相较快的通过色谱柱 (1) 高压输液泵 主要部件之一，压力：150～ 350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的 固定相（10μm），液体的流动 相高速通过时，将产生很高的压 力，因此高压、高速是高效液相色 谱的特点之一。应具有压力平稳、 脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等 特性 3. 梯度洗脱装置：相当于气相色谱中的程序升温，在样品分离过程中按一定的程序通过改变流动相中两种（或两种以上）溶剂的比例来调整流动相的极性、离子强度、pH值 外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。 内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。 二 . 进样系统 1. 隔膜注射进样器 2. 高压进样阀 三. 分离系统—— 色谱柱 不锈钢制成，内壁抛光，长度5-30 cm id: 4-5 mm 四. 检测系统 检测器应具有：灵敏度高、噪音低、线性范围宽、定量准确、适应范围广等特点，同时还应该对温度和载液流速的变化不敏感。 ? 可用的检测器有：紫外、荧光、折光、电化学、质谱等 ? 常用的检测器有：紫外-可见光度检测器和示差折光检测器 1. 紫外-可见光度检测器 （包括固定波长型和可调波长型） 固定波长型：常采用汞灯的254 nm或280 nm谱线 可调波长型：光电二极管阵列检测器（photodiode array detector, PAD) 光