TCDD对大鼠卵巢颗粒细胞E2和P分泌的影响研究.pdf

持久性有机污染物论坛2008暨第三届持久性有机污染物全国学术研讨会论文集 TCDD对大鼠卵巢颗粒细胞E2和P分泌的影响 许虹1，许振成p，张素坤2，邢福祺1 (1南方医科大学，广州，；2环境保护部华南环境科学研究所，广州，510640； ‘联系人，E·mail：xzc@scies．com．cn) 1．引言 近年，越来越多的流行病学研究资料表明野生动物和人类的生殖发育系统、免疫系统、神经系 统和行为异常以及某些肿瘤的发生率上升与环境内分泌干扰物(EDCs)有关。其中2，3，7，8一四氯二 体重或更低)暴露剂量下便干扰整个机体的内分泌调节、损伤免疫系统、神经系统、诱发痛症等毒 性作用，尤其具有雌激素样或抗雌激素样的内分泌干扰作用，造成严重的生殖与发育障碍。在人类 生殖领域，不孕不育夫妇日益增多且很多仍面临当今医学尚无法解释的原因，这促使我们不得不思 考TCDD等环境内分泌干扰物对人类生殖影响的程度和范围实际上可能远远超过我们既往的估计。 实际上，TCDD对人和哺乳动物的生殖毒害乃至对人卵巢功能的毒性作用程度和机制至今仍在 探索中，有研究指出TCDD对人类生殖健康的影响主要是通过抑制卵巢甾体激素牛成途径。大多 数研究证实TCDD抑制卵巢颗粒细胞雌j一醇(E2)的分泌，但其毒性作用的具体剂最、机制和是 否抑制乳酮(P)的分泌尚存在着争议。本研究采用TCDD染毒体外培养大鼠卵巢颗粒细胞，检测 其对细胞活力和E2、P分泌的影响，探索TCDD对卵巢颗粒细胞的毒性作用阂值和程度，为实现对 EDCs的环境风险管理及有效阻断EDCs对人类生殖可能构成的偶然损害提供基础性科学数据。 2．材料与方法 2．1材料 (1)实验动物 学医学院动物中心提供。 (2)试剂 M199培养基(仆ⅣITROGEN公司)、青霉素和链霉素(天津灏洋生物制品科技有限公司)、 科技有限公司)。 (3)器材 2．2方法 (1)动物模型及颗粒细胞分离 50m，48 ①取25—29d未成熟雌性SD大鼠，每只一次性腹腔注射PMSGh后颈椎脱臼处死。 ②打开腹腔无菌条件迅速取出双侧卵巢，40倍解剖显微镜下小号针头穿刺有腔卵泡，轻轻挤压 使卵母细胞及周围的卵丘细胞、颗粒细胞同时逸出，反复轻轻吹打使卵母细胞与卵丘细胞分离，使颗 粒细胞释放入预冷M199培养基中。 持九性有机污棠物论坛2008暨第=届持丸性有机污染物空国学木研讨台论￡集 ③l 的2x106圳胞，扎接种6扎细胞培养板，细胞贴1#后打*种处螋。 (2)顿{t细胞的蝽葬及处理 细胞贴壁后更换去激素血清的培养疆，继续培养24h后PTcDD分别进行刺檄。水实验根据 文献报逆和预实骑结果，分成不同的刺激时司段和不同剂昔纽如r(何寅骑纽均设3复孔)。 ∞THⅢ*m ofq“№HⅥnm Tc曲(nM)： “m目M： 检if☆h、-T‘nD(nM)：“№目㈣- *Ⅻm#： m#≈M z¨ 目％#女 jOTⅢ 0h Ⅻ№镕☆ 01％DMs0 E， m Et 01 P 3n P (3)E2和P的垃铡 舟置再孔培养涟，录用放射矧蛆RIA)沾检删E2和P俯，按试剂龠说明书操作方法操作， (4)M1T待删方法 ①U台盼蓝检删活山大于95％的卵巢颗粒细胞咀10“孔密度种干96孔细胞培养饭。细胞贴聃 后换正m汕继续培莽24h．佳细胞同步化于G0期。 onM ②后以不d镕l』量TcDD刺激24h和lTcDD刺激不d时目段，每实验组均设3复孔，刺馓 结束。 ③加入5m∥m1的M1’r20uv孔，37℃，5％c02孵肯4h。 50u1，孔，先分混匀，以492nm十BmTek酶杯仪分析OD值。 ④小心吸峁t清被．加入DMsol 3．结果与讨论 3．1大鼠卵巢颗粒细胞的培养 刚接种时颗粒细胆早球形，3h后贴壁生K；挟液后继续培养24h，形态不规