中国医科大基础医学生物化学课件 第十四章 基因重组与基因工程.ppt

　 　基因重组与基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering　 第 一 节DNA的重组DNA Recombination Holliday模型中，同源重组的4个关键步骤 ①两个同源染色体DNA排列整齐 ②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体 ③通过分支移动产生异源双链DNA ④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为： 　 　 转导过程 第 二 节 重组DNA技术 一、相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 二、基本原理及操作步骤 （二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 （三）目的基因 cDNA (complementary DNA) 基因组DNA (genomic DNA) 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 （一）目的基因的获取 1. 化学合成法 　　已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) PCR的反应体系　 模板DNA 引物 4种dNTP Taq DNA聚合酶 含Mg2+的缓冲液。 PCR的基本反应步骤及原理　 （1）变性，加热至95 ℃，使模板DNA解开成单链； （2）退火，温度降至适宜，使引物与模板互补结合； （3）延伸，温度升至72 ℃ ，DNA聚合酶以4种dNTP为底物，在引物的3’-OH上，合成与模板互补的DNA新链。 PCR反应条件　 　　 　　　　　　 　 　 三、重组技术与医学的关系 　 　 复习思考题： 　1. 概念： （1）克隆 （2）转化 （3）转位 （4）基因工程 （5）转座 （6）限制性核酸内切酶 （7）载体 （8）G文库 （9）质粒 （10）c文库 2. 简述基因工程的基本过程。 3. 简述目的基因的主要来源或途径。 重组DNA医药产品 预防霍乱 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗 预防乙肝 乙肝疫苗(CHO, 酵母) 利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗 单克隆抗体 抗组织损伤 超氧化物歧化酶 激活、剌激各类白细胞 白细胞介素 抗病毒感染及某些肿瘤 干扰素(? 1b, ?2a, ? 2b, ?) 治疗糖尿病 胰岛素 治疗侏儒症 生长素 刺激细胞生长与分化 生长因子(bFGF, EGF) 剌激白细胞生成 促红细胞生成素 剌激白细胞生成 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 促进凝血 血液因子VIII 抗凝 组织胞浆素原激活剂 功 能 产 品 基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。 （三）基因诊断 基本过程 区分或鉴定DNA的异常 分离、扩增待测的DNA片断 标准 . 能正确扩增靶基因； . 能准确区分单个碱基的差别； . 本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定; . 便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。 （四）基因治疗 定义 基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。 方式 体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy) 性细胞基因治疗 (germ line gene therapy) 1. 产前诊断 2. 携带者测试 3. 症候前诊断 4. 遗传病易感性 （五）遗传疾病的预防 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 3.　cDNA文库　 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T 　　是一种在体外利用酶促反应大量获得