第六章-抗体的表达.pptVIP

第六章 抗体的表达 * 目前抗体的主要类型： 1、多克隆抗体：通过免疫手段制备。 2、单克隆抗体：通过杂交瘤技术制备。 3、基因工程抗体：包括嵌合抗体、改型抗体等，通过基因工程手段制备，涉及设计、构建与表达等。 第一节 概述 * * 要想获得全长的抗体分子，就必须选择恰当的抗体表达系统，而要使所表达的蛋白质结构不具有免疫原性或避免半衰期过短，就需要使用一个标准的抗体工程技术生产全人抗体。 在抗体表达过程中，选择一种合适的表达系统，要考虑多种因素的影响，包括抗体的结构、糖基化作用以及表达抗体的产量、纯化的难易度和生产成本等。 目前用于抗体表达的系统有原核表达系统和真核表达系统两大类。 * * 表达系统的选择主要取决于表达抗体的用途和抗体的产量，而产量影响着抗体的经济效益。 如果表达的抗体属于小分子片段，无需抗体效应作用和药物动力学活性，选用细菌表达系统就足够了。如scFv渗透性好，免疫原性弱，可以很快从血液中清除掉，常用与放射免疫检测和肿瘤的原位治疗。 如果表达的抗体用于治疗，需要延长抗体的药物动力学活性时间即抗体的半衰期，那么就需要选择全抗体，需要利用培养的动物细胞或转基因动物来表达。 * 原核表达系统操作简单、成本低、周期短，应用最为广泛，但不能对表达产物进行糖基化，且细菌类毒素污染很难去除。重组的蛋白常以包涵体形式分泌，要在体外折叠，费时费力，这使得大规模生产抗体受到限制。 真核表达系统是最接近天然产生抗体的表达系统，比较成熟且应用较多。主要用于表达完整抗体分子，已可达到100mg/L的表达水平。但真核细胞培养有难度，需要附加设备，需要去除癌基因序列，防止病毒污染等。 * 蛋白表达系统 大肠杆菌表达系统 昆虫细胞表达系统 哺乳动物表达系统 酵母表达系统 真核表达系统 存在一些蛋白不能有效地折叠，发酵周期较长，容易污染，需要考虑表达产物的卫生安全性，筛选产物价格昂贵，有时表达产物没有生物活性等问题都为临床生产和应用带来了不便，也存在产物低表达或不表达的问题，产物纯化问题依然存在 外源基因不能持久稳定地表达，而且表达成本很高，技术背景复杂 存在不正确的糖基化修饰，且表达量低 原核表达系统具有吸引力的原因在于它的成本低、生产率高和能够大规模快速的生产等优点 * 第二节 原核表达系统 原核表达是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达。人们为了获得高水平的基因表达产物，通过综合考虑控制转录、翻译、蛋白质稳定性及向胞外分泌等诸多方面的因素，设计出了许多具有不同特点的表达载体，以满足表达不同性质、不同要求的目的基因的需要。 * 原核细胞表达系统基因表达的主要特点是： 1、原核生物只有一种RNA酶，识别原核细胞启动子，催化所有RNA的合成，且其基因表达是以操纵子为单位。 2、转录和翻译是耦联的，连续进行。 3、缺乏真核细胞转录后的加工系统，不能去除内含子。 4、原核细胞的基因控制主要在转录水平。 5、在大肠杆菌mRNA核糖体结合位点上，有一个转录起始密码子和S-D序列。 * 原核表达系统主要有大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉素表达系统以及枯草杆菌和蓝细菌表达系统等。 大肠杆菌遗传背景清楚，遗传图谱明确，生物化学与分子生物学充分了解，目的意淫表达产量高，生产成本低，周期短等，因此仍是表达异源性蛋白质的首选表达系统。 受大肠杆菌自身加工能力的限制，不适合表达完整的抗体分子，多用来选择性表达Fab或scFV等抗体片段。 * 一种表达体系的核心是表达载体及宿主菌，而表达方法的进步也主要体现在载体元件的优化和宿主菌基因型的改造上。 理想的原核表达载体应具有以下特征： （1）稳定的遗传复制和传代能力； （2）具有显性的转化筛选标记； （3）启动子的转录是可调控的，抑制时本底转录水平较低； （4）启动子转录的mRNA能够在适当的位置终止，转录过程中不影响表达载体的复制； （5）具备适用于外源基因插入的酶切位点，以确保目的基因按一定方向与载体正确衔接表达产物的分离、纯化。 * 常用的原核表达载体分类及特征 PET载体 转录载体：用以表达本身带有原核核糖体结合位点和AUG起始密码子的目的基因 翻译载体：包括来自T7噬菌体主要衣壳蛋白的高效核糖体结合位点，用于表达一些不带有核糖体结合位点的目的基因 pET-21（+）、pET-24（+）和pET-23（+） pET载体系统为满足不同的需求，生产了带有His·Tag、T7·Tag、S·Tag、GST·Tag、ompT、CBD S·Tag、Thioredoxin、DsbA·Tag 、Trx·Tag等标签的融合蛋白，其中带有S·Tag、His·Tag、T7·Tag的蛋白易于通过蛋白质杂交检测。 * pET 28a载体