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克隆基因表达——原核表达 ; 基因克隆的意义 通过外源DNA的重组、克隆以及鉴定，获得大量的需要的特异DNA克隆； 外源克隆基因在某种表达载体及适宜的宿主细胞中表达相应的蛋白质。;目的基因——克隆载体 表达载体 受体细胞（宿主细胞） 表达产物的分离和纯化 ; 最佳的基因表达体系：目的基因的表达产量高、表达产物稳定、生物活性高和表达产物容易分离纯化。这就要求选择合适的宿主细胞，合适的表达载体和适当的纯化方案。 ;宿主细胞应满足以下要求：;第一节 外源基因表达;一、原核生物表达体系;经过长期的研究，已经掌握了有关大肠杆菌基础生物学、遗传学以及分子生物学等方面的背景知识，特别是对基因表达调控的分子机理； 被发展成为安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体系列； 许多克隆的真核基因，如生长素和胰岛素基因等已实现有效的、高水平的表达； 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，因此易于进行工业化批量生产。 ;（一）对外源目的基因的要求;（一）对外源目的基因的要求;（二）原核生物表达载体;（二）原核生物表达载体;表达载体的一般结构;具有复制子 有多克隆位点 有选择性遗传标记如抗药基因 ;（三）真核生物基因在原核细胞中的表达;常用的非融合型表达载体pKK223-3 抗氨苄青霉素基因 Tac启动子 SD序列 AUG起始密码 转录终止序列T1和T2 ;融合型表达蛋白 含义：指蛋白质的N端由原核生物DNA序列或其他DNA序列编码（标签蛋白），C端由真核生物DNA序列编码 优点：融合蛋白具有抗原性可以作为抗原，利于蛋白产物的鉴定和纯化；稳定外源蛋白防止细菌蛋白酶的破坏；标签蛋白可被蛋白酶切割 注意问题：外源基因的阅读框架必须与标签蛋白的阅读框架相符合 ;融合型表达系统主要有： 金黄色葡萄球菌蛋白A系统 His系统 GST系统 β-半乳糖苷酶系统 麦芽糖结合蛋白系统;;（三）真核生物基因在原核细胞中的表达;;不可溶性表达——包涵体 含义：是大肠杆菌高效表达外源基因时形成的由膜包裹的高密度、不溶性和无活性、大小为0.5－1um的蛋白质颗粒 特点：表达量高且易于分离纯化，但需要复性。 ;1.包涵体的形成原因 表达产率过高，超过了细菌正常的蛋白水解能力，导致产物聚集； 原核生物缺乏翻译后修饰加工所需酶类和辅助因子，使中间产物大量积聚而形成包涵体； 发酵温度过高或胞内pH接近蛋白的等电点时易于形成包涵体。 ;2.包涵体的分离与纯化 常用的裂解方法有机械破碎法、溶菌酶法、超声破碎法等； 包涵体溶解的原理：加入强蛋白质变性剂，通过离子间的相互作用，使包涵体蛋白分子内和分子间的各种化学键断裂而易于溶解； 常用的变性剂有：盐酸胍（5－8mmol/L）、尿素（5－8mmol/L）等。 ;3.包涵体蛋白质的复性 含义：包涵体中蛋白质必须恢复其生物活性，通过逐步降低变性剂浓度，可使表达蛋白恢复其天然构型； 常用方法：稀释复性、透析复性、超滤复性和柱上复性等，为了提高复性率，可采用氧化－还原系统、添加低分子化合物、分子伴侣和折叠酶等。 ;（三）真核生物基因在原核细胞中的表达;大肠杆菌表达系统存在的不足; 例：利用重组大肠杆菌生产人胰岛素;;人胰岛素的生产方法;;;;;;;;;;; 主要基因工程表达体系比较; 重组DNA医药产品（目前上市???有300多种）