免疫组化原理-2012.4.2.pptVIP

免疫组化的原理 张斌 天津医科大学 免疫组化原理 免疫组化的原理 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。 原理： 组织或细胞内的某种化学物质（待检测物） 抗原 免疫动物 抗体 检测（免疫组织化学） 荧光素 酶 金、银颗粒 P-ERK：一抗：鼠来源的单克隆抗体. 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法 三、免疫组化染色方法的类别 直接法 间接法 PAP法 ABC法 LSAB法 一步法（EPOS） 两步法（Envision） 直接法 将荧光、酶、金直接标记在一抗上进行显色，没有联结系统、未用桥抗体。 优点：特异性高、非特异染色轻。 缺点：敏感性低，要求抗体浓度高。每种一抗均需用酶来标记 PAP法过氧化酶-抗过氧化酶法 组成： 一抗是针对靶抗原的特异性抗体 二抗是联结抗体，一面联结一抗，另一面联结PAP复合物 三抗是以过氧化物酶为抗原，在与一抗同种动物身上诱发产生的抗体，并与辣根过氧化物酶形成复合物（PAP） PAP法（过氧化酶-抗过氧化酶法） 优点： PAP复合物中含酶更多，且是一种非标记的免疫组化方法，敏感性更高 PAP复合物常来自两种不同的动物（鼠、兔），鼠PAP用于一抗为单克隆抗体的染色，兔PAP多用于一抗为多克隆抗体的染色 可用于福尔马林固定的石蜡切片 ABC法（亲和素-生物素法） 组成： 一抗、生物素化的二抗、ABC复合物（亲和素+酶标生物素） 优点： 亲和素和生物素有强大亲和力，使其比直接和间接酶标法更敏感，也超过PAP法。 能用于常规石蜡切片。 亲和素 生物素 酶 亲和素有四个生物素分子特异性结合部位，其结合力强，不可逆，还可和辣根过氧化酶或荧光素等结合 亲和素-生物素复合物是一个三维空间的结构，它利用亲和素为中介，一端通过生物素化的抗体联接第一抗体，另一端通过生物素化酶与显色系统相连接，产生多级放大，从而提高此生物反应的敏感性和特异性 AB复合物多用于ABC法的免疫组化中 亲和素—生物素复合物（ ABC ） LSAB（SP）法标记的链霉亲和素-生物素法 特点：将HRP直接标记于链霉亲和素上 优点： 更快速：空间结构更小 更敏感：链霉亲和素的亲和性更强，更易于到达深部位点 非特异背景更少：链霉亲和素空间结构特殊，不易与高荷电的组织成分（胶原纤维、结缔组织）联结 酶标亲和素 在AB复合物中，酶是标记在生物素上，而后与亲和素合成复合物。在标记的亲和素-生物素方法中是将辣根过氧化酶直接标记在亲和素上，辣根过氧化酶与亲和素间有极强的结合力，因此LSAB法比ABC法更敏感 一步法（EPOS）及两步法（Envision） 特点 以多聚体为载体，联结了酶和一抗（一步法）或二抗的Fab段和酶（二步法） 优点 操作简便，省时 提高了敏感性和特异性 减少了背景着色 避免内源性生物素的干扰 多聚物载体 一步法及二步法载体试剂，可分别称DAKO EPOS及DAKO Envision试剂 核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分子，起到载体的作用 一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种能与二抗相联结的由HRP标记的多聚物 辣根过氧化酶的免疫组化染色的反应过程: HRP + H2O2 HRP?H2O2 有色分子终末产物 + HRP DAB（电子供体） HRP：酶 H2O2：底物 HRP?H2O2：酶?底物复合物 受氢体为过氧化氢； 供氢体较多包括DAB； 抗体抗原的结合是肉眼看不见的，显色系统的目的就是使这种看不见的反应变为看得见，从而确定抗原的存在及其定位，显色系统由酶、底物加上显色剂组成，若显色剂为DAB，则出现棕褐色细颗粒沉淀 DAB(3,3-二氨基联苯胺显色液) 配法:DAB 50mg 0.1mPBS 100ml 30%H2O2 30-40ul PBS的PH和离子强度的使用 免疫组化原理及流程介绍 建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M 中性及弱碱性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分