生物制药工艺学 第7章 凝胶层析08-3-25.pptVIP

第七章 凝胶层析(Gel chromatography) 分子筛层析 (molecular sieve chromatography) 凝胶过滤 (Gel filtration) 排阻层析 (exclusion chromatography) 将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，由于各组分流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离的层析方法。 洗脱曲线 第一节 凝胶层析原理 凝胶层析的分离过程是在装有多孔物质填料的柱中进行的。 柱的总体积为Vt，它包括填料的骨架体积Vg，填料的孔体积Vi(内水体积)以及填料颗粒之间的体积V0（外水体积）。 Vt= Vi +V0+Vg 一、原理 当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分子在柱中停留时间比大分子停留的时间要长，样品各组分即按分子大小顺序而分开，最先淋出的是最大的分子。 Ve=V0+Vi Kd flash 二、凝胶层析的几种理论 （一）平衡排除理论 （二）扩散分离理论 （三）流动分离理论 （一）平衡排除理论 当溶质层流过一个填料颗粒这段距离时，溶质分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。 平衡条件是在流速很慢时的一个极端情况。 （二）扩散分离理论 溶质分子在流经凝胶柱的过程中，在流动相和固定相之间没有达到平衡，存在着流速依赖性。 （三）流动分离理论 红细胞在毛血细管中流动时比血浆流得快. 较大的分子较先通过或绕过这个填料颗粒，使溶质能按其大小进行分离。 分离过程 三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝胶柱进行分离。 样品加入，以水或其他溶液进行洗脱，即得洗脱曲线 。 分离过程 最先流出物质A，A分子量最大，只能从颗粒间隙流过， “全排阻”。其流经体积最小，等于外水体积V0。 最后流出物质C，它分子量最小， “全渗入”。流经体积是外水体积与内水体积之和V0+Vi。 物质B分子量介于渗入限与排阻限之间。 “部分排阻”或“部分渗入”。流经体积Ve是全部外水体积加上内水体积的一部分，即Ve=V0+KdVi 三、分配系数Kd 排阻系数： 当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。 当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。 0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。 物质的Kd值 Kav 有效分配系数 过柱法测定V0及Vi Ve=Vo+KdVi 如用全排阻（Kd=0）或全渗入（Kd=1）的物质过柱，测量其洗脱体积，计算该凝胶柱的V0值及Vi值。 蓝色葡聚糖（Kd=0） 重铬酸钾（Kd=1） 分配系数测定 Kd 思考题 已知两种蛋白在Sephadex G-100上的Kd (如血清白蛋白Kd为0.2，细胞色素C为0.7)，通过Kd 的大小我们能得到哪些信息？ 四、凝胶层析的特点 （1）凝胶层析操作简便，所需设备简单。 （2）分离效果较好，重复性高。 （3）分离条件缓和。 （4）应用广泛（除盐，分子量测定，分离纯化）。 （5）分辨率不高，分离操作较慢。 第二节 凝胶的结构和性质 一、葡聚糖凝胶 (Sephadex) 二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex) 三、聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P） 四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ） 五、多孔玻璃微球 (Bio-glas) 六、疏水性凝胶（hydrophobic gels） 一、葡聚糖凝胶 (Sephadex) 商品名为Sephadex G类 . 交联葡聚糖的基本骨架是葡聚糖。 再经3-氯-1，2-环氧丙烷为交联剂，形成三维网状结构的高分子化合物。 其交联度是通过交联剂的加量及反应条件来控制的。 Sephadex G 编号间接反映： 1、吸液量； 2、溶涨时间； 3、凝胶孔径； 4、分离范围 葡聚糖凝胶性能与编号的关系 葡聚糖凝胶（G类）的规格 思考题 用葡聚糖凝胶分离蛋白质与多糖时，其分离范围不同，为什么？ 葡聚糖凝胶（G类）特点 1、孔径。 2、稳定性。 3、吸附作用。 4、芳香族化合物和杂环化合物。 保存 保存的方法有干法、湿法和半缩法三种。 湿法：加入一定量的防腐剂置于冰箱中作短期保存（6个月以内）。 常用0.02%叠氮化钠、0.02%三氯叔丁醇、20%乙醇等。 二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex) （一）亲脂性葡聚糖凝胶（Lipophilic Sephadex） 骨架结构上引入一些有机基团，如甲基、羟丙基，使呈亲脂性，同时保留亲水性。 （二）交联葡聚糖离子