猪繁殖与呼吸综合征病毒受体结合域的初步鉴定研究.pdfVIP

兽医部分 79l 猪繁殖与呼吸综合征病毒受体结合域的初步鉴定。 安同庆” 周艳君贺云霞田志军徐灵龙仇华吉 王云峰童光志一 (中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨15(1001) 摘要：为确定猪繁殖与呼吸综合征病毒的唾液酸粘附素受体结合域，本文从全长水平、分段水平及结构域水平上将 唾液酸粘附素分子进行转染PRRSV非允许细胞，结果发现第一个结构域单独可以介导病毒的吸附。在此基础上原核表达 了该结构域并制备兔高免血清，该血清*-Tr；t明显抑制病毒与PAM细胞的吸附。实验证实唾液酸粘附素的第一个结构域参 与病毒与PAlM细胞的吸附。 关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine and syndromevirus，PRRsv)具有典型的嗜单 reproductiverespiratory alveolarIl瑚． 核细胞／巨噬细胞特性，在体内，PRRSV主要感染分化的巨噬细胞，其中肺泡巨噬细胞(porcine 续性感染和免疫逃避的原因之一。受体是病毒进入细胞的第一道屏障，病毒与细胞受体结合是病毒建立 又可以介导病毒的内吞[3】，但是迄今为止受体上参与病毒结合的结构域，病毒上参与受体结合的蛋白及 其结合位点还不得而知。本文以功能性受体Sn为切人点，对受体上的病毒结合域进行了探讨。 1材料和方法 1．1 材料 PRRSV 提供；PRRSV核衣壳蛋白的单克隆抗体由兽医生物技术国家重点实验室周艳君博士惠赠；实验用3周龄 左右小猪来源于哈尔滨郊区某养殖场。 1．2 PAM细胞总RNA的提取及8n基因的克隆 酸粘附素基因(GeIlBank 列见表1。以TMTAR引物和随机引物进行反转录，分别用4对引物进行PCR扩增基因片段。PCR产物 经1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并克隆到pMDl8一T载体(TaKaRa)中进行序列测定。 ·基金项目：973计划“动物重大传染病病原变异与致病的分子机制”(编号20015cB523200)。 ··作者简介：安同庆(1978年9月生)，男，河北沧州人，在读博士研究生，研究方向为动物病毒分子生物学。 ．．·通讯作者：童光志研究员．Tel：0451E—ImilIgnong@hvri．∞．∞。 792 o2006学术年会 1．3全长唾液酸粘附素表达载体的构建 将SS的两条引物退火后插入到pcDNA3．1(+)的舰I和踟RI位点，得到重组质粒pSs。将TMTA 片段经NotI和Xba I处理后进行连接得到Sia23，然后再用Nae Kpn 经EcoR I和Not I处理后克隆到质粒pSSTM中，即全长的Sn片段，将此质粒命名为pSn。 1．4转染PRRSV非允许细胞与IFA检测， 细胞为PRRSV非允许细胞，于转染前一天将细胞接到6孔细胞培养板中，待细胞长至70％～80％融合时 用lipofectaminTM N蛋白的 单克隆抗体为一抗，FITC标记的羊抗鼠Is,G(中杉公司)为二抗进行间接免疫荧光。细胞转染时设立 pcDNA3．1(+)载体、PBS对照以及不接毒的PKl5细胞对照。 1．5分段唾液酸粘附素的转染与检测 在全长唾液酸粘附素转染结果的基础上，本实验进一步将分段的唾液酸粘附素Sial(49—1755nt)、 I位点之间，构建了3个 进行间接免疫荧关检测，方法同上。 1．6氨基端结构域的转染与检测 根据分段Sn的转染结果，在预测蛋白结构域的基础上，将Sial片段中包含第一个结构域的氨基端1 细胞，经病毒感作后进行间接免疫荧关检测，方法同上。 1．7氨基端短肽的原核表达及高免血清的制备 I和Not 将氨基端150个氨基酸的基因片段经EcoR I处理后插入原核表达载体pGEX一6p一1中，经