猪体外成熟卵母细胞玻璃化冷冻后纺锤体、染色体的形态变化以及孤雌发育的能力研究.pdfVIP

2004学术年会 猪体外成熟卵母细胞玻璃化冷冻后纺锤体、 染色体的形态变化以及孤雌发育的能力。 史丈清，朱士恩”，杨中强，侯云鹏，田树军，周光斌 中国农业大学动物科技学院，北京 】00094 摘要：本文目的是研究冷冻后猪体外成熟卵母细胞的骨架变化与体外发育的能力，采用玻璃化 冷冻方法保存猪体外成熟卵母细胞，分析玻璃化冷冻液处理和OPs冷冻一解冻后的卵母细胞外部形 态、微管和染色体形态，以及冷冻后卵母细胞孤雌发育能力。体外成熟培养44h的猪卵母细胞(MII 期)随机分为毒性试验组、OPS／．T冷冻组、OPS／+T冷冻组和对照组(不处理)。卵母细胞分别处理后 外部形态特征进行鉴定供免疫荧光染色实验和孤雌发育实验使用。实验结果表明：玻璃化冷冻明显 地损伤了猪成熟卵母细胞纺锤体和染色体形态，玻璃化冷冻显著地降低其电激活后孤雌发育能力。 EDFS40对猪成熟卵母细胞纺锤体有损害作用。Taxol可以减轻冷冻对纺锤体的损伤，明显地提高冷 冻后卵子的孤雌发育能力。 关键词：猪卵母细胞玻璃化冷冻纺锤体染色体免疫荧光染色孤雌发育 1前言 哺乳动物卵母细胞冷冻保存不仅成为保护品种资源和拯救濒危动物不可缺少的技术保障，而且 也是人类辅助生殖技术(ART)的重要研究内容。玻璃化冷冻方法具有许多优点，其操作程序简单， et 耗时少、更安全有效(Liebermann a1．，2002)，所以在卵母细胞冷冻保存的胚胎生物技术研究中已成 et eta1．．19991 为不可缺少的技术手段。利用玻璃化冷冻方法在多种哺乳动物的胚胎(Raila1．．1985；Lane et et a1．，1986；“m 和卵母细胞(Trounson pulled et 移植后产犊(Vajta et et 1健康女婴(Kuleshovaa1．．1999)。 et 猪卵母细胞对低温的敏感，有学者提出MII卵母细胞除去脂滴后再冷冻的方法(Nagashima et a1．，1999)，但有人认为细胞内脂质是卵母细胞的能量来源和未来胚胎发育中所需物质(Isachenko a1．，1998)，而且显微去脂出生的后代有无不良发育还未知晓。冷冻保存未成熟的卵母细胞在使用前 要受制于解冻后的ⅣM效率，对不去除脂滴的MII期猪卵母细胞直接玻璃化冷冻，还未见相关报道。 本实验从冷冻体外培养成熟的猪MH卵母细胞入手，探讨冷冻液和冷冻．解冻后卵母细胞形态、微管 和染色体形态结构的变化与对应的孤雌发育能力的关系，为研究和提高冷冻后卵母细胞体外生产效 率奠定基础。 2材料和方法 2．1猪卵巢的收集与体外成熟 +国家“863”项目(2004AA21 3070)资助。史文清，男，32岁，在读博士研究生 “通讯作者E—mail：zhushien@cau．edu．cn 2004学术年会 23 从屠宰场收集新鲜卵巢(均来自青年母猪)，于2h内带回实验室，采集卵巢表面宜径2～8mm卵 泡中的卵丘一卵母细胞复合体(COCs)，挑选有3层以上完整卵丘细胞且胞质均匀的COCs微滴培养。 l EGF+10 成熟培养液为TCMl99(GIBCO，12340—030)+10％gP泡液(PFF)+0mg／ml半胱氨酸+10ng／ml IU／mlPMSG+10lU／ml 至MII期。 2．2玻璃化