猪圆环病毒Ⅱ型的分离鉴定及其DNA疫苗的初步研讨.pdfVIP

猪传染病 猪圆环病毒II型的分离鉴定及其DNA疫苗的初步研究木 黄勇王红宁郑连军柳萍陈锦锐李进史巧 (四川农业大学动物科技学院动物预防医学生物工程实验室) 摘要：对疑似猪断仔猪衰竭综合症的病料进行PCR检测，将PCR检测为阳性的病料接种PKl5细胞，盲 株的全基因组序列，序列测定结果表明，该毒株的全基因组为1767bp，与国内外分离株的同源率为 肌肉注射免疫小鼠，用ELISA诊断试剂盒检测小白鼠的血液中特异性抗体情况。结果表明，小白鼠在第2 周产生了抗猪圆环病毒II小型的特异性抗体，第4周抗体水平达到最高，抗体可维持8周以上。 关键词： 猪圆环病毒2型全基因组真核表达质粒DNA疫苗免疫抗体 猪圆环病毒(Porcine 原性及核苷酸序列的差异，可将PCV划分成了无致病性的猪圆环病毒1型(PCVl)和有致病性的猪圆环 wastingsyndrome multisystemic 目前还没有有效的猪圆环病毒疫苗，防疫该病较为常用的方法是做好其它重要疫病如猪瘟、猪蓝耳病、猪 喘气病等的防治，同时搞好饲养管理。但是这些预治措施仍不能很好控制PCV的发生。进行猪圆环病毒疫 苗的研究是近年的热点和难点。 ． 猪圆环病毒II型的ORF2基因编码的核衣壳蛋白(Cap)是该病毒主要的免疫原性蛋白【引。本实验首先 进行猪圆环病毒II型四川株的分离鉴定和基因组测序，然后将其Cap基因作为目的基因，插入真核表达质 粒构建出猪圆环病毒II型ORF2基因的真核表达质粒，观察其对老鼠的安全性和产生免疫力 1．材料与方法 1．1材料 1．1．1毒株与病料 本实验采用的PCV2对照毒株(NJ)由南京农业大学陈傅言教授赠送；病料从眉山、乐山、南部县、 蒲江、遂宁等地区的疑似PWMS病猪采集其淋巴结，肺脏，肝脏，脾脏等组织和血清。 1．1．2质粒、载体，菌株、菌种和实验动物 购自Invivogen公司，Balb／ct]、鼠：雌性，体重20．259，购于四川大学实验动物中心。 1．1．3试剂 DNA聚合酶、dNTP、Proteinase Marker 1640粉剂、小牛血清、Taxt DNA (DL2000)、UNIQ．10柱式DNA胶回收试剂盒等购自上海生物工程有限公司：T4Ligase、辣根过 氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体等购自宝生物公司；猪圆环病毒ELISA诊断试剂盒由华中农业大学病 毒室提供。其他试剂按《动物病毒学》【7卜《分子克隆实验指南》．181介绍的方法制备。 1．2方法 1．2．1猪圆环病毒的分离鉴定16-81 ， 从全省各地疑似猪断仔猪衰竭综合症的病猪无菌采集脾脏、淋巴结等作为病料，提取病料中的病毒 一DNA，取适量用作PCR模板。 302 ’ 第六次全国会员代表大会暨第11次学术研讨会 部分片段。 P1： “5，_一TACATGGTrACACGGATATrG一3” P2： “5，-—GCACTTCllTCGTllTCAG一3” 引物由上海生物工程技术公司合成。 Buffer 在一个50rt]反应体系中依次加入10xPCR 49l，引物P1(50pmol／L)l“I，引物P2(50pmol／L)lgl，模板DNAlgl，Taq 退火，72℃1min PCR产物在1％的琼 30s延伸，30个循环；然后72℃延伸10min：最后设置为4℃。取5p．1 脂糖凝胶上电泳检测。 buffer l 19l，PCR产物51