猪源H9N2亚型流感病毒HA基因的序列测定及真核表达研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会 小鼠免疫试验：将纯化蛋白与适量佐剂乳化成油包水液，免疫小鼠，每只皮下分点注射 抗原50ug，免疫前l天、免疫后7天、13天分别断尾采血，收集血清；14天时进行二免， 二免后5、10天分别采血收集血清。 血清抗体检测：用纯化的抗原蛋白包被ELIsA板，检测血清抗体：分别以H1Nl、H3N2 病毒做抗原，血凝抑制试验检测血清抗体。 2结果 根据合成基因序列，体外扩增。获得了与预期大小一致的300b口的基因片段，该片段经 双酶切，连接到PET30(a)载体，PCR鉴定，成功获得了含有外源目的基因的重组质粒。 利用IPTG诱导表达．获得了分子量为19kd的蛋白带，在菌体浓度OD值为O，6．O．8， IPTG终浓度O。OlmM，诱导4-5h’表达蛋白量最高， 表达蛋白的纯化：该表达载体含有His．tag多肽，采用亲合层析方法在变性条件下洗脱， 获得了较好纯化效果。 w防cem 生免疫学反应，产生特异性反应带。 小鼠免疫试验。二免后，ELIsA检测针对免疫蛋白抗原，试验组血清OD值显著高于对 照组。且能抑制sⅣH1Nl、H3N2与红细胞的血凝反应。 3结论与讨论 研究成功构建表达了含有SIvHlNl、H3N2亚型HA、NA蛋白抗原表位模拟蛋白，且 表达蛋白具有与H1Nl、mN2亚型阳性血清发生免疫学反应的生物学特性，表明该表达蛋 白具有SIv病毒的免疫原性和反应原性。构建的串联表位，包含了来源于SIvH1Nl、H3N2 HA基因的T、B表位抗原，可同时诱导机体T、B淋巴细胞反应．具备理想疫苗的特性。 小鼠免疫2次后．试验组血清抗体显著高于阴性对照组，而细胞免疫学指标正在检测中。 以重组表位抗原作为新型疫苗研制，一方面可避免采用全病毒基因片段而出现的重组、 整合等问题．安全性好；另一方面出于抗原片段短，可将来源于不周病原、不周基因的表位 串联表达，研制多价疫苗；而且还可以通过串联多拷贝基因达到提高免疫效果的目的。因此 近年来表位疫苗研究倍受关注．由于动物流感病毒基因组高度变异，重组几率高的特点，传 统疫苗潜在危险均很大．表位痘苗则是动物流感病毒疫苗研究的新方向。 参考文献路 猪源H9N2亚型流感病毒HA基因的序列测定及真核表达 韩庆功u．乔传玲’．扬焕良1。陈艳1。辛晓先。，丁选亚1．陈化兰” (1．中田农业科学院哈尔滨善医研究所善医生物技术困末重点实验室农业部动物流感重点开放实验室哈 尔滨黑龙江15000l2．河南科技学院动物科学学院新乡河南453003) 表迭靓体pcAGGs上．经酶切分析，PcR茔定和测序验证，得到重组表达质杜pcAOGs-HA，之后将其转 检测．蛄果表明pc∞G-姒能够在体外瞬时表达具有免疫擘活性的HA蛋白，通过免疫小鼠，对其免疫效 果进行7初步研究． 关键词；猪流感病毒；HA基因：序列测定；真棱表选 猪流感(swine Innuen殖，SI)是由正粘病毒科流感病毒引起的～种急性、高度接触传染性 的猪呼吸道疾病。临床以突发、高热、咳嗽、呼吸困难、衰竭、高发病率、低死亡率为特征， 单纯sI的病理变化主要表现为病毒性肺炎及其它呼吸器官的炎性变化，但有其它痛原继发 或混合感染时．病理变化会严重而复杂川。 猪的传染病 H9N2亚型流感病毒为低致病性流感病毒，目前流行于世界各地，其不仅给养禽业带来 严重威胁，而且还可以感染猪及人类口。J，同时还是引起97年香港流感的H5Nl亚型禽流感 病毒的内部基因的供体【4J，因此，对H9N2亚型流感病毒研究近几年倍受世界流感研究工作 者的关注。Markwell等在1998年4月。从香港的家猪体内分离到了两株H9N2流感病毒， 这是首次从哺乳动物体内分离到H9N2亚型的流感病毒，之后在多次的全国流感流行病学调 查中，又从不同省、市分离出多株H9N2亚型流感病毒，说明近几年H9N2亚型流感病毒已 经成为中国大陆猪群中重要的流行毒株。本研究对一株猪源H9N2亚型流感病毒 而检测了HA蛋白在体外的表达情况及免疫效果。 l材料与方法 1．1病毒 猪流感病毒A，Swine／zheji∞卯佗004(H外屹)是采集健康猪鼻腔棉拭子，按常规方法进行 流感病毒的分离、鉴定而获得。经SPF鸡胚增殖、纯化后，．700c保存备用。 1．2试剂、酶硬质粒 RNA提取试剂TrizoI、M．MLV反转录酶、E