猪瘟病毒E2基因的表达及其间接ELISA诊断方法的研讨.pdfVIP

猪瘟病毒E2基因的表达及其 间接ELISA诊断方法的研究 摘 要 本研究试图从分子生物学角度来揭示目前猪瘟仍频繁发生的原因，为广泛开展 CSFV分子流行病学的研究提供基础资料，为CSF的防制提供科学依据和理论支持，为 猪瘟诊断提供稳定的标准诊断抗原及诊断方法。本论文由4部分构成: 1.应用RTPCR和nPCR扩增了7株国内近期流行的CSF野毒E2基因，分别克隆 于pGEM-TEasy载体，对其进行了核普酸序列测定及氮基酸序列推导，同时将其与C 株，Alfort株，Brescia株进行了同源性比较及遗传进化分析，并构建了CSFV的遗传发 生树。结果表明.7株流行野毒与C株，Alfort株，Brescia株核昔酸序列同源性分别为 91.60/x^-94.5%,89.2% 92.7%和85.9%-89.3%,氨基酸同源性分别为91.2%^-95.80/x, 88.9%^92.0%和84.0%-90.1:而7株野毒之间的差异很小，其核昔酸序列同源性为 95.8%-99.7%,氨基酸同源性为%.3%~99.1%。所绘制的遗传发生树分为2个组群， 所测得7株流行野毒均属于第1群，而且可分为两亚群，都与C株在同一亚群。表明现 行猪瘟病毒流行株的变异呈现一定的多样性，并不尽向远离疫苗株的方向变异，现行的 猪瘟疫苗在一定程度上仍然可以起到保护作用。 2应用RT-PCR技术对中国猪瘟兔化弱毒株，经典强毒株石门毒株((Shimen)，近期 地方流行的属于第一群毒株的新疆毒株(XJ)和第二群代表毒株甘肃临挑(LT)株E2基因 的主要抗原区(包括A,B,C,D)进行扩增，均得到约561bp的基因片段。将这4个基 因分别克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，经酶切、PCR扩增和测序分析确证其正确 插入到表达载体中，且阅读框正确，从而构建成重组表达载体。重组质粒转化至宿主菌 BL21(DE3)中，用异丙基硫代一S-D一半乳糖昔(IPTG)进行诱导表达，用SDS电泳， Western-blotting和薄层凝胶扫描分析表达的蛋白。结果表明，E2基因的主要抗原区可 以在大肠杆菌中表达，表达的蛋白多以包涵体形式存在，表达产物的分子量约为 50kDa(目的基因的蛋白分子质量为21.7kDa，载体GST分子质量为29kDa)，与理论推 测的蛋白分子质量一致;薄层凝胶扫描分析表明，表达蛋白约占菌体蛋白总量的30%- 40%;经Western-blotting证明，表达的E2蛋白可被猪瘟阳性血清所识别，表达蛋白可 用于基因工程诊断抗原。 3.C株和LT株E2基因主要抗原区在pGEX-4T1表达载体中表达产量较高，但是都 以包涵体形式存在，必须经过复性才具有生物学活性。收集诱导表达的菌液，超声波破 碎分离包涵体，尿素和TritonX-100分别洗涤包涵体，用尿素溶解包涵体，复性液稀释 变性蛋白，缓冲液透析获取纯化蛋白，并测定了蛋白的免疫活性。SDS分析电泳 结果表明，尿素和TritonX-100可洗去部分杂蛋白，8moUL尿素能很好的溶解包涵体， 回收率较低约10%，其纯度可达70%oELISA试验测定的结果显示，与复性前变性蛋白 相比，纯化蛋白与CSFV阳性血清反应的特异性提高20倍左右。可以批量生产基因工 程诊断抗原来取代全病毒抗原，有望进一步研制针对E2的单克隆抗体，为CSF的诊断 提供先进的技术。 4，用纯化的猪瘟病毒重组E2蛋白作为抗原包被酶标板，以辣根过氧化物酶(HRP) 标记的兔抗猪IgG为二抗，建立了检测猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法，并确定了 ELISA最佳工作条件:C株和LT株抗原包被浓度分别为8.7gg/mL和11.7[g/mL,370C 放置Ih后，再4℃过夜，猪瘟阳性血清(1:160)在37℃作用Ih，二抗((1:800)37℃作 用45min，底物溶液37℃显色15min。通过重复性试验，交叉试验，特异性试验和稳定 性试验等试验结果表明该方法重复性好，特异性强，灵敏度高;与用猪瘟全病毒为抗原 的ELISA试剂盒，间接血凝试剂盒比较，特异性为97.14%,敏感性为93.18%，两者的 符合率为95%，经统计学分析，这两种检测方法的检验结果无显著性差异(P0.05)。用 己建立的方法检测临床血清样本 148份，总阳性率为68.91。本研究结果为猪瘟诊断 方法的标准化提供了实验基础，为猪瘟的诊断与监测提供一种良好的技术手段。