方法学评价试验——重复性试验(TP).pptVIP

方法学评价试验---重复性试验;什么是方法学评价;方法学评价常用技术性能指标;方法学评价常用技术性能指标;方法学评价常用技术性能指标;批内重复性试验是将同一材料分成数份实验标本，在尽可能短的时间内平行测定20次； 日内重复性试验是将同一材料分成数份实验标本，在1天内作5轮，每轮4次测定，获得20个测定数据； 日间重复性试验是将同一材料分成20份实验标本，每天测定1份，连测20天。 分别作统计处理即可测得候选方法的批内、日内和日间的随机误差。;血清(浆)总蛋白(TP)测定;血清(浆)总蛋白(TP)测定;血清(浆)总蛋白(TP)测定;重复的肽链结构 酪氨酸和色氨酸残基对酚试剂反应或紫外吸收 与某些染料特异结合的能力 采用沉淀反应借助浊度或光折射原理测定 电泳的迁移率大小;凯式定氮法（N） 双缩脲法（肽键） 酚试剂法（Lowry法） 比浊法（沉淀）;电泳法 紫外分光光度法;常用染料有氨基黑、丽春红、考马斯亮蓝、邻苯三酚红钼等。 氨基黑、丽春红常作为血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳或琼脂糖凝胶电泳的染料。 考马斯亮蓝(Bradford)1976年由Bradford建立，该法灵敏度最高（1~5μg），试剂配制简单，检测速度快（5~15分钟）、简便，，干扰因素少(强碱性缓冲液；TritonX100；SDS)，颜色深浅随不同蛋白质变化。适用于要求灵敏度高的微量蛋白质快速定量测定，如尿液、脑脊液等。但有染料粘附比色杯上不易洗脱的缺点。;邻苯三酚红钼也可用于测定尿液、脑脊液蛋白质含量，既不粘附比色杯 ,又具有高灵敏度，已有用于自动化分析测定尿液蛋白质的试剂盒。 还有测定Alb常用的染料甲基橙、溴甲酚紫(BCP)、溴甲酚绿（BCG）等，目前应用最广的是BCG。此法操作简便，灵敏度高，重复性好，适合自动分析；且球蛋白一般与阴离子染料不结合，无干扰作用。是清蛋白测定的常规方法，应用最广。;利用抗原抗体特异反应 免疫比浊法、免疫扩散法、免疫沉淀法、免疫化学法等;蛋白质分子中的肽键在碱性条件下，与Cu2+产生稳定的紫红色络合物。与两分子尿素缩合后生成的双缩脲在碱性溶液中与Cu2+的反应相似，故称为双缩脲反应。络合物颜色的深浅在一定范围内与蛋白质的???度成正比（与蛋白质分子量及氨基酸成分无关），与同样处理的蛋白质标准液比较，经计算即可求出血清总蛋白质含量。;1.样本：收集无溶血、无脂浊、无传染性疾病、肝肾功能正常的人混合血清。;血清(浆)总蛋白(TP)测定;方法学评价试验---重复性试验;2.根据以下公式求出均值和标准差s： 表示各测定值总和；i=1表示从第1个样本值开始加，加到第n个x值，本实验共20个测定值。;3.离群值检验 用求得的均值和标准差对20个测定值进行检验，如果其中有一个数据超过X±3S时，该数据为离群值。剔除该数据后补做一个实验数据后重新计算X和s。有两个以上离群值时，重新进行实验，本次实验作废。 4. 计算CV。;5. 如试验求得的血清TP双缩脲试剂法的CV值＜WHO对中等实验室提出的OCV(±3%)标准，即表明实验条件的控制达到最佳条件，试验结果可按OCV%报告。作为方法探讨实验，其变异系数应该＜OCV标准。;6.变异指数得分（VIS） ;方法学评价试验---重复性试验;方法学评价试验---重复性试验;（二）变异指数得分（VIS） ;1．为了缩小测定值的离散程度，操作中必须准确加入标准液及标本量，并严格控制反应时间，准确读数。 2．严格遵守“五同一短”的原则，尽量减少人为误差。 3. 黄疸血清、严重溶血、葡萄糖、酚酞及溴磺酞钠对本法有明显干扰，可设标本空白管来消除。含脂类较多的血清加入双缩脲试剂后会出现浑浊，可用乙醚3ml抽提后再进行比色。 4. 一些氨基酸和肽类缓冲液，如Tris缓冲液，可产生阳性显色反应，不宜采用。;为何在双缩脲试剂中加入酒石酸钾钠和碘化钾？ 双缩脲试剂法测定蛋白质的技术特点和临床意义。 重复性实验的目的和意义。