细胞周期和细胞凋亡.pptVIP

坏死细胞 活细胞 AnnexinV / PI的双染色法： 左下象限显示正常活细胞，为FITC- / PI-； 右上象限为坏死细胞，为FITC+ / PI+； 右下象限为凋亡细胞，呈现FITC+ / PI- FITC PI 凋亡细胞 AnnexinV / PI的双染色法检测凋亡细胞 优点： ①对早期凋亡细胞检测灵敏 ②细胞不需固定，省时省力。 ③结果更可靠。 注意：胰酶的消化时间 三、凋亡调控基因及凋亡相关因子的检测 ㈠与细胞凋亡有关的基因和相关因子 1.生存基因（死亡抑制基因） ①促进细胞存活的基因： bcl-2基因家族： 主要功能：延长细胞的寿命，对细胞周期和分化不产生影响；抑制多种模型的细胞凋亡。 存在部位：bcl-2蛋白主要定位在核膜、 ER膜、mi膜上。 ②促进细胞增殖的基因 如：c-myc、c-abl、ras相关基因 2.死亡基因 (1)促进细胞死亡的基因 caspase基因家族： Bax基因：Bax过度表达，可拮抗bcl-2的促进细胞增殖作用及抑制程序性细胞死亡。 ⑵抑制细胞生长的基因: P53基因、Rb基因 (二)凋亡调控基因和因子的检测方法 1、免疫组织化学方法 适用于冰冻或石蜡包埋的标本 2、流式细胞术 可检测细胞悬液或培养细胞中荧光标记的凋亡相关的基因产物 3、RT-PCR法检测凋亡调控基因的mRNA表达 4、基因芯片 思考题 1、简述细胞凋亡的分子机制（可以选择三种通路其中一种） 2、简述检测细胞凋亡最新的几种方法。 侧向散射光 侧向散射光 前向散射光 前向散射光（FSC）：检测细胞大小 侧向散射光（SSC）：检测细胞内部结构 （胞浆内颗粒多少, 核质比） 根锯FSC/SSC，就可以分开全血样本中的淋巴细胞，单核细胞和中性粒细胞。 Laser Beam Shaping Lenses Flow Cell Forward Scatter Detector Side Scatter Detector 525BP FL1 (FITC) 575BP FL2 (PE) 620BP FL3 (PI) 675BP FL4 (PC5) 488DL 488BK 550DL 600DL 645DL 荧光检测器 常用荧光染料的特性 荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色 FITC 488 525 免疫荧光 绿色 PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620 免疫荧光 橙红 PeCy5 488 675 免疫荧光 红 PI 488 620 DNA染色 橙红 PECy7 488 755 免疫荧光 深红 PerCP 488 670 APC 633 670 超高频电晶体充电后振动→液流断裂为均匀的液滴→ 将液滴充以正负不同的电荷→当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转→落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。 分选原理 DNA含量 Annexin V - PI 的双染色法检测细胞凋亡原理： Annexin V 质膜 磷脂酰丝氨酸 结合 新月状 八字形 花瓣状 黑洞样 眼球状 环状 细胞核断裂成碎片 染色质浓缩，形成多种形态 图：细胞凋亡时超微结构的变化 凋亡早期细胞 上皮细胞 巨噬细胞 凋亡小体形成 被巨噬细胞吞噬的凋亡小体 凋亡小体迅速被巨噬细胞吞噬 由膜包裹的凋亡小体 染色质浓缩 细胞核破裂 形成凋亡小体 细胞膜向外突起 DNA ladder （2）Bcl-2蛋白家族成员及生物学效应 Bcl-xl、Bcl-xs、Bax、Bad和线虫的ced-9等（共同具有BH1和BH2两个保守区域） Bax：诱导凋亡，以同源二聚体形式存在，也可与Bcl-2形成异源二