TritonX-100对红细胞中抗去污剂膜蛋白拆离的影响.pdf

Science TechnologyVision 科教前哨 科 技 视 界 2012年03月第09期 TritonX一100对红细胞中抗去污剂膜蛋白拆离的影响 张敏妍 ’张 明 (1．中国人民解放军第四军医大学生物医学工程系 陕西 西安 710032；2．西安理工大学 陕西 西安 710048) 摘【 要】采用离心方法从红细胞中分离得到红细胞膜，并用非离子去污剂TritonX-IO0溶解细胞膜中的非脂筏成分，经过 不连续蔗糖密度梯度 离心分离抗去污剂膜成分．用考马斯亮蓝染色法检测不同组分中蛋白质含量。实验发现，孵育液／膜溶液的 体积比、TritonX一100的浓度会产生不同的影响。用原子力显微镜对蛋白质含量最高组分中的成分进行观察，结果显示颗粒大 小为50一lOOnm左右 ．其成分为脂筏蛋 白。 【关键词】非离子去污剂；脂筏蛋白；原子力显微镜 去污剂是一种能在水中形成微囊的双亲性小分子 ，这种 5mM／L磷酸盐 ，pH7．4)重悬，离心 15min(2400xg，4℃)，除去 微囊可以与脂双层发生相互作用形成磷脂和去污剂混合的 上清液及沉淀表层，重复洗涤 3次。洗净的红细胞用4体积 微囊，或者是蛋白质、去污剂以及磷脂混合的微囊 ，它们是以 预冷的浓度为 lOmmol／L的Tris—HC1缓冲液(pH7．4)重悬 ， 磷脂一去污剂一蛋白质或者是去污剂一蛋 白质混合物的形 4℃静置2h，完全溶血。离心 15min(7900xg，4℃)，沉淀用浓度 式存在于水溶液中_1_。非离子型去污剂TrtionX一100已经广 为 lOmmol／L的嘶s—HC1缓冲液 (pH7．4)重悬 ，重复离心和 泛地应用于不同的学科领域，人们对T~ionX一100与脂质、蛋 重悬四次．直至得到乳白色的絮状沉淀，沉淀4℃储存。 白质之间的相互作用进行了研究 ，发现TrtionX一100促使了 1．2．2 脂筏成分的萃取 脂质混合物中脂筏结构的形成并且会诱使脂筏微区内的相 在4~C条件下，用PBS溶液对膜溶液进行孵育，然后与蔗 态发生改变2[-31。Trtionx一100作为阻断缓冲液时，它的疏水结 糖溶液混合．蔗糖最终浓度为40％(m／v)，取0．6mL混合液于 构域的存在使得整合蛋白和膜的结合非常紧密 ，溶解下来的 离心管底部，依次铺置 1．8mL30％蔗糖溶液，1．2mL5％蔗糖 膜蛋白能够保持较强的活性，并且通过透析可以容易地除去 溶液 ，离心 18h(230，O00xg，4℃)，从上层开始以400~L为单 去污剂 ，在脂筏拆离的实验4[1中它已经成为人们首选的非离 元分别抽取分离的膜片段 ，共为 9个组分 ，离心 lOmin 子去污剂。我们对Tritonx一100的浓度以及孵育液／膜溶液的 (15000xg，4℃)，4℃储存。 体积比(V，v)进行了研究，得出了最佳的体积比、浓度。用原 1．2．3 蛋 白质含量的测定 子力显微镜对蛋白含量最高组分进行了观察 ．鉴定出其蛋白 采用考马斯亮蓝染色法 (Bradford法)测定蛋白质含量旧， 质主要成分为脂筏蛋白。实验结果对于迅速、高效的分离脂 配制浓度为 lmg／mL的牛血清蛋白溶液为标准液，绘制标准 筏蛋白质提供了一定的参考依据。 曲线 ，然后对样品进行测定。由标准曲线计算得出1．2．2中离 心得到的各组分中的蛋白质含量。 1 材料与方法 1．2．4 原子力显微镜的观察 1．1 材料与仪器 将 1．2．3中检测得出的蛋白含量最高的组分用去离子双 血液样品由陕西省血液中心提供 。Tris、TritonX一100、牛 蒸水稀释 10