实验5 原位杂交.pptVIP

核酸分子杂交技术 实验对象：海蜇胚胎-横裂体和碟状体 主要应用有：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定位、定性、定量检测、特定基因的时空表达模式和疾病的诊断等方面。 1、模板的制备 体外转录合成反义探针的模板（原位杂交所用的探针）是DNA的编码链 体外转录合成正义探针（原位杂交中的阴性对照）的模板是DNA的模板链 海蜇补体系统相关基因wnt3在海蜇胚胎中原位杂交 实验操作 1)从胚胎中除去hybridization buffer。探针回收，-20°C 保存 2)Wash 1 洗涤胚胎2 次，60°C，每次20 分钟 3)Wash 2 洗涤胚胎2 次，60°C，每次20 分钟 4)Wash 3 洗涤胚胎2 次，60°C，每次20 分钟 5)Wash 4 洗涤胚胎2 次，60°C，每次20 分钟 6)加入MAB，6min。 6)封闭。1ml 2% blocking solution 与胚胎作用，室温作用2h。 7)抗体孵育。1μl 10mg /ml 抗体加入到2ml 1% blocking solution，混匀，与 胚胎反应4°C 过夜。 7)洗涤。 (1)小心除去抗体，用MAB 洗4 遍，室温每次30min，摇动使洗涤充分。 (2)换用TMNT buffer 室温洗2 遍，每次10min。 8)显色、记录。 (1)用NBT/BCIP 显色，室温，放入暗处10 分钟镜检观察信号。 (2)用PBS终止显色，进行拍照记录。 10分钟后可观察一下，如显色较慢，可间隔时间较长再观察，如显色较快，需经常观察。 实验注意事项 试剂和容器处理：DEPC（焦碳酸二乙酯）或180 ℃ 需带口罩，手套，注意RNase-free 移除溶液时，应轻吸，以免损伤胚胎 加液时，应注意从侧面加入，以免直接冲击胚胎 电子版上交mRNA在海蜇胚胎中的表达图； 根据实验结果，推测该基因在早期发育的可能功能 思考：影响原位杂交成败的关键因子及原因； 如何保证探针的特异性 如何合成正义探针和反义探针（选哪个酶切，选哪个酶合成等） 杂交技术的原理 杂交：核苷酸序列通过Watson-Crick碱基配对原则形成稳定的杂合双链核酸分子的过程，称为杂交。 杂交的三种形式：DNA-DNA,DNA-RNA和RNA-RNA，其稳定性依次增大。 检测对象：提纯的核酸和细胞内的原位的核酸。 核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性。 方法一、制备质粒模板 方法二、PCR法： 在引物中引入启动子序列，聚合酶选用高保真、末端不加A的酶。 目的片段克隆到载体(pGEM-pEasy) 将PCR产物与pEasy-T3连接，连接是非定向的，需要测序确定连接的方式。 体外转录法合成RNA探针 A、质粒提取（彻底抽提蛋白，避免有机溶剂残留） B、酶切（酶切位点的选择原则）： 使合成的探针长度在200bp-1000bp； 尽量选常见的酶；分清编码链和模板链。 C、酶切产物的回收 胶回收或沉降回收（回溶或洗脱时要用DEPC处理的水，切勿混入超过0.1M的EDTA）。 体外转录法合成RNA探针 5’ ATG TAA TAC ATT 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ TTA CAT AAT GTA 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ ATG TAA TAC ATT A B 如果插入方向如图A，则反义探针的合成，应用限制性内切酶在靠近T7启动子的位置将质粒线性化，然后用SP6 RNA聚合酶来合成探针 T7 Sp6 T7 Sp6 如果插入方向如图B，则反义探针的合成，应用限制性内切酶在靠近SP6 启动子的位置将质粒线性化，然后用 T7 RNA聚合酶来合成探针 2、体外转录 混匀后37℃ 2.5小时 加2ul DNase 1 (RNase-free)，37℃ 20分钟，消化DNA模板 加入1ul EDTA（pH8.0）终止反应。 体外转录法合成RNA探针 试剂及材料 体积（20ul） 溶于DEPC处理水中的线性化质粒 1ug in 10ul 水中 含DIG标记的NTP Mix 1ul 转录缓冲液（10×） 1ul RNA聚合酶（SP6、T7或T3） 1ul(20 U/μl) RNA酶抑制剂 1ul 配制新鲜电泳缓冲液TAE和琼脂糖胶，以降低RNA的降解速度。 点DNA marker估计其分子量。 体外转录法合成RNA探针 3、探针检测 体外转录法合成RNA探针 5、探针效率测定 A、将探针稀释成不同的浓度，点1μl于尼龙膜上，80度烘膜3h（或120度烘烤30min），固定探针； B、Washing buffer 洗膜2min；