探讨脐带间充质干细胞培养的改良方法.docVIP

精品论文 参考文献 探讨脐带间充质干细胞培养的改良方法 陈义　陈敏 福建省莆田学院附属医院眼科　福建　莆田　３５１１００ 　　【摘要】　目的　在传统组织块贴壁法培养的基础上,寻找一种改良的脐带间充质干细胞培养方法.方法　将脐带组织制作成约０．３X０．７cm２大小组织片, 称之为:脐带组织片,进行悬浮培养(改良法:组织片悬浮法);观察其形态结构、生长特性;并进行成骨细胞诱导培养,测定多向分化潜能.结果　采用改良法成功培养出脐带间充质干细胞;其生物学特性与传统的组织块贴壁法培养的细胞一致.并证实了其干细胞特性.结论　改良法较传统组织块贴壁法简便,可靠, 成功率高. 【关键词】　脐带间充质干细胞;　培养;　组织片悬浮法【中图分类号】R７１４．５ 【文献标识码】B 　　【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－０２３７－０２　　 　　近年来组织工程角膜研究的不断兴起,脐带间充质干细胞作为组织工程种子细胞有着广阔的应用前景.本实验旨在寻找一种改良的脐带间充质干细胞培养法. 　　１　材料与方法 　　１．１　试剂　DMEM/F１２培养基,胎牛血清,EDTA,地塞米松,维生素C,beta;－甘油磷酸钠. １．２　脐带　脐带取自产科手术健康足月胎儿,在超净台内,去除残留的血液、脐带外膜组织、动静脉后待用. 　　１．３　组织片悬浮法(改良法)　将上述脐带组织剪成约０．３X０．７cm２片状,我们称之:脐带组织片.将组织片放入培养皿中,每个培养皿４片,加人适量含胎牛血清的培养基中,此时组织片处于悬浮状态,培养皿放置恒温培养箱,温度３７℃,含５％CO２.间断对培养皿换液.定期观察. １．４　组织块贴壁培养法(传统方法)　将脐带组织剪碎成细小组织块,接种培养皿中,干燥贴壁后加人适量改良培养同样培养基,培养皿放置于培养箱中. 间断对培养皿换液.定期观察. １．５　向骨细胞定向诱导分化　将胎牛血清、地塞米松、DMEM/F１２培养液、beta; －甘油磷酸钠、维生素C 以不同浓度制成成骨诱导培养基.取传代３~５代细胞,按５times;１０５个/片密度接种在２５cm２培养皿中.培养１d后,加入上述培养基进行诱导,时间２１d,观察其变化.２１d后用ALP 钙钴法染色. 　　２ 　结果 　　２．１　组织片悬浮法(改良法)　组织片悬浮于培养皿中(图a),应用改良法培养１０d左右,在培养皿底部,见细胞比较均匀贴附,单层分布(图b).部分细胞短杆状,考虑为刚贴壁不久的细胞,大部分呈典型成纤维状,培养皿中无造血细胞或内皮细胞形态样细胞混合,细胞成分单纯.５d后,细胞生长融合(图c), 为形态一致长梭形成纤维细胞.此时将组织片移除.用０．２５％胰蛋白酶对融合后的细胞进行消化传代,接种于培养皿中,传代后细胞生长旺盛,３d后传代细胞即生长至９０％融合. 　　２．２　传统组织块贴壁法传统贴壁法培养约１０d,组织块边缘有细胞爬出,贴附培养皿底部(图d),形态为长梭形成纤维细胞,同改良法培养一致.所培养细胞由组织块向周围扩散生长,５d后达到融合.此时将组织块移除.用胰蛋白酶对融合后的细胞进行消化传代,接种于培养皿中,传代后细胞生长旺盛,３d 后亦达到９０％左右融合. 　　２．３　成骨细胞诱导结果鉴定在成骨细胞诱导２１d后,细胞形态转化为多角形,部分为不规则形态;碱性磷酸酶(ALP)钙钴法染色显示细胞呈阳性反应, 细胞胞质内钙质沉积经染色呈黑色. 　　 　　 　　３ 　讨论 　　脐带间充质干细胞具有取材方便、来源广泛、且具多项分化潜能等优点受到了研究者的青睐[１－５].已有学者将其应用于组织工程角膜方面的研究[６]. 作者之前的应用改良方法培养兔角膜基质细胞的研究[７],为本实验改良法的研究打下基石. 目前有众多学者自脐带的华通氏胶组织中培养出脐带间充质干细胞[８．９], 比较传统的有组织块贴壁培养法和胰蛋白酶消化培养法,作者在实验初期,参考众多文献,反复多次尝试应用以上传统方法进行培养,发现实验条件很难掌握,成功率极低,如胰蛋白酶消化法,酶的浓度,血清浓度,消化时间,离心转速等,摸索很长时间,才偶然培养出原代干细胞,且成功率低,实验可重复率低; 组织块贴壁法则存在组织块贴壁不牢,易漂浮脱离培养皿等问题,即使组织块贴壁牢固,经过重复多次实验,成功率仍然极低.本文作者在前期应用改良方法培养兔角膜基质细胞—基质片悬浮法取得成功,可重复率极高,故尝试应用该改良方法—脐带组织片悬浮法培养脐带间充质干细胞,发现此方法成功率亦高,实验极具可重复性.该方法应注意将脐带华通氏胶分离干净,去除脐带上积血、脐带外膜及血管组织,并将脐带剪成适当大小,过大容易沉至培养皿底部,过小则如传统组织块贴壁后漂浮一样,导致实验失败.本实验对培养基要求较高,尽量采用良好的培养基及胎牛血清.加至培养皿中的