短发夹RNA介导RNA干扰的时间和剂量效应研究.pdfVIP

生物化学与生物物理进展 Prog．Bioch哪．Biophys． 1．2．3 钾，5 mmol／L氯化镁的 shRNA表达载体构建．．s以I过夜酶切 mmo儿亚铁氰化钾，2 D—PBS，1 pAvU6+27，核酸纯化法回收酶切产物后，再用 g／LX—gal)1m1并在37℃温育过夜．次日 m1 X6口I过夜酶切，核酸回收，Cm处理，1％琼脂每孔加入2 D—PBS润洗，在倒置显微镜下观察 糖电泳鉴定．将1．2．2中经磷酸化的shIⅢADNA双细胞，并估计蓝色细胞(p．gal阳性)的比例．每孔 链与具．s以I及x60 随机计数100个细胞，共计数6个培养孔．以上过 I粘末端的pAVu6+27载体用 T4 DNA连接酶过夜连接，连接产物转化DH50【感 程独立重复3次，p—ga邯日性细胞占总细胞百分比 受态细菌，氨苄青霉素(100g／L)LB平板抗性筛选．的平均值代表该细胞株的转染效率． 1．3．4干扰质粒的脂质体转染．采用6孔板或 次日挑取阳性克隆，在含氨苄青霉素(100∥L)的 35 LB培养基中250r／min37℃震荡培养14～16h，小 I 量提取质粒，随后用X^oI及B伽H37℃双酶切 6h，2％琼脂糖电泳鉴定．阳性克隆载体送上海生工 生物工程技术服务有限公司测序验证(Hi曲GC 7 content 测序引物为： 5 TCTTGG protoc01)， TGCAG GTAGTT3’． 1．3细胞培养与脂质体转染 1．3．1细胞培养．HEK293H、HeLa细胞株为本室培 养维持，用DMEM高糖培养基、10％胎牛血清 bovine (fetal senlII】，FBS)、1％青链霉素(penicillin s仃eptomycin，PS)培养．0．25％胰酶用于消化细胞， 常规计数、冻存，数码荧光倒置显微镜01yIIlpus h后 Ix71用于细胞形态观察并摄像． 1．3．2转染条件的优化．pCMVp．gal质粒可用于监 测转染条件、确定转染效率及作为荧光素酶活性检 两者比例为1：8， 转染组均用 测的内参使用．转染前，对髓怼93H、HeLa细胞psh—pGL3， 株的转染条件进行优化，即确定最佳脂质体试剂和 性检测依据Luciferase DNA的量．转染前一天，胰酶消化并计数细胞， Assay 24孔板接种，使其在转染日密度为85％～90％．对程序，pCMVp．gal分析同上． OPTI．MEM 1．4 于每孔细胞，分别使用50¨1 I培养基 RNAi的半定量RT．PCR检测 收获预定时间点的培养细胞，用T地01提取 稀释Lipofect锄ine2000(LF2000)及pCMVp—gal， 四组实验中质粒pCMVp—gal分别加入100n昏 细胞总I矾A后，立即冰上分装、冻存(一80℃)，余 200 样用于I斟A浓度测定，并调整样品至同一工作 ng、300ng、400ng，而每组6孔的LF2000的 量依次为0．2斗1、0．4斗1、0．6斗l、0．8斗1、