使用α-n-乙酰半乳糖胺酶和新型α-半乳糖苷酶在同一缓冲液.pptVIP

* * * * α-N-乙酰半乳糖胺酶的分子量及等电点测定 * * α-N-乙酰半乳糖胺酶理化性质研究 Km ＝63 μM Vmax ＝768 μmol/(L·min) Kcat ＝ 7.47 s－1 Kcat /Km ＝ 118.5 (s·μΜ)－1 动力学常数曲线 * αNAGA的最适温度 15 ℃ ～45℃ α-N-乙酰半乳糖胺酶理化性质研究 αNAGA的最适pH 最适pH在6-7之间 金属离子及部分化合物对酶比活力的影响 1U 浓缩RBC的酶解 样本：A(Rh＋) 1U pRBC＋0.9mg A酶，37℃1h 酶解前 酶解后 （三）、AB→O血型转变 酶解缓冲液的选择 甘氨酸缓冲液：1: 250mM的甘氨酸（pH 6.8） 2: 250mM的甘氨酸,3mM NaCl （pH 6.8） 3: 200mM的甘氨酸,3mM NaCl （pH 6.8）(liu) PCS缓冲液： 0.1M柠檬酸45.5ml，0.2M Na2HPO4154.5ml，水115.7ml（pH 6.8） 利用单糖底物测活的结果如下： 　 a-N-乙酰半乳糖胺酶 a-半乳糖苷酶 PCS缓冲液 120% 100% 甘氨酸缓冲液 100% 72%-87.5% M B O A AB B O A AB α-N-乙酰半乳糖胺酶和α-半乳糖苷酶 在不同缓冲液中与红细胞的结合能力 α-半乳糖苷酶 α-N-乙酰半乳糖胺酶 甘氨酸缓冲液 PCS缓冲液 无细胞对照组 甘氨酸缓冲液 甘氨酸缓冲液 B型红细胞 O型红细胞 B型红细胞 PCS PCS 甘氨酸1 甘氨酸2 PCS 甘氨酸2 酶解红细胞所需酶的最低剂量 在甘氨酸缓冲液中B酶的酶解效率比在PCS缓冲液中提高了45倍 AB型红细胞中的A/B抗原比A、B型红细胞内密度低 ECO RBCs A-zyme dose(mg/ml) B-zyme dose (mg/ml) anti-A anti-B A1-ECO RBCs 0.06 0 0.03 0 0.015 0 0.01 0R B-ECO RBCs 0.2 0 0.1 0 0.05 0 0.025 0R A1B-ECO RBCs 0.2 0.1 0 0 0.1 0.05 0 0 0.05 0.025 0 0 0.03 0.01 0 0 0.015 0.005 0 0 　 0.01 0.0025 0R 0R A2B-ECO RBCs 0.04 0.1 0 0 0.02 0.1 0 0 0.01 0.05 0 0 0.005 0.025 0 0 0.004 0.01 0 0 0.002 0.005 w+ 0 0.001 0.0025 w+ 0 0.0002 0.00125 w+ 0 　 0.0001 0.000625 w+ 0 使用α-N-乙酰半乳糖胺酶和新型α-半乳糖苷酶在同一缓冲液（中性条件)进行AB →O血型转变 酶解前 酶解后 抗A单抗 抗B单抗 酶解转变对未来输血模式的影响 三、mPEG修饰红细胞技术 血型系统对输血的影响 解决之道： 制备无（稀有）血型的红细胞。 2012年已知32个血型系统 输血反应可能性增加 稀有血型血液供应不足：(熊猫血：ABRhD-)，突发事件供应紧张; 配型困难：反复输血的病人（肿瘤、贫血、白血病、AIHA等） mPEG修饰红细胞表面抗原的原理 原理：PEG及其衍生物与红细胞表面-NH2、-SH2基团结合并形成水 化层，隔离了抗原抗体的结合，但不影响小分子的细胞内外交换。 5种端基mPEG修饰红细胞血型抗原的比较 血型系统 mPEG浓度 (mmol/L) ABO Rh Duffy Kell P Kidd MNS mPEG-ALD 6.0 3.0 3.0 3.0 — 3.0 3.0 mPEG2-NHS 10.0 6.0 6.0 6.0 — 6.0 6.0 mPEG-MAL 6.0 6.0 6.0 6.0 — 6.0 6.0 mPEG-BTC 1.5-2.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.5- 1.0 mPEG-SPA 1.5-2.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.5- 1.0 mPEG-BTC和 mPEG-SPA是修饰红细胞抗原的最佳衍生物！ mPEG修饰后的红细胞血型鉴定 修饰前红细胞的血型 mPEG修饰红细胞血型 微柱凝胶法 血型系统 Rh MNSs