样本处理对HBV+DNA荧光定量结果影响初探研究.pdfVIP

样本处理对HBVDNA荧光定量结果影响初探 王凡1蒋宏君1潘丽2 (1云南省临床检验中心650032，2玉溪市人民医院653100) 【摘要】目的探讨核酸提取过程对HBVDNA荧光定量PCR结果的影响，使定量结果更准确、 更稳定。方法分别用加热裂解法、NP40加热裂解法、沉淀加热裂解法提取核酸；考察离 心机、NP40颗粒对定量结果的影响。结果沉淀加热裂解法提取效率最高，用冷冻离心机 则提取效率更好，NP40颗粒对阴性标本及阳性标本均有影响。结论应重视样本处理对HBV DNA定量检测的影响．荧光定量PCR检测HBVDNA时应采用统一的样本处理方法，才能保证 结果的可比性，同时应注意NP40颗粒对测定结果的影响。 【关键词】聚合酶链反应： 标本制备：DNA病毒 荧光定量聚合酶链反应(FQPCR)准确定量检测乙型肝炎病毒(HBVDNA)对乙型肝炎的临 床诊断、治疗监测及预后判断有重要临床意义和参考价值，其前提是定量必须有很好的重复 性。影响PER定量结果的因素，除PCR本身外，核酸提取过程对聚合酶链反应法准确检测HBV DNA含量有很大影响，作者就此进行了初步探讨，结果报告如下。 材料与方法 l材料 1．1标本：取l例临床确诊乙型肝炎且乙型肝炎病毒核酸(HBVDNA)拷贝数在107～108拷贝／ml 的血清： 1．2试剂：HBVDNA荧光定量PCR试剂盒为上海复星生物技术公司产品，批号 Gene2000realtime 1．3仪器：Rotor cycles实时荧光定量PCR仪为澳大利亚Corbette 科学学仪器厂品：恒温金属浴为(日系独资)杭州大和热磁电子有限公司产品；H一1旋涡 微型振动器为上海青甫沪西仪器厂产品。 2方法 2．1标本核酸提取方法的影响： r／minX10 2．1．1加热裂解法：取直接血清50ul直接加热100．【2×10min、离心13000 min， 取上清液待测。双份提取。 ， 2．1．2NP40加热裂解法：取待检血清25ul加入等量0．4％NP40，充分混匀，100℃加热10 ．246．． min、再离心13000r／min×lOmin，取上清液待测。双份提取。 2 l r ／Ⅲin×lO min，去上滴．加入25ui04舯40．充分混匀后．在100℃加热10min，再离心13000 r／minXl0 min，取上清液特测。双份提取。 2 2离心机转速的影响：用沉淀加热裂解法提取核酸时．各取10份样本，离心时分别用 机用公式RCF=I (cm)，g为重力，温度设为4℃．频率为217。 23NP 40颗粒影响：取阴性对照及阳性标本，用沉淀加热裂解法提取核酸后，在加模扳时。 NP40颗粒分别占模板量的1／4，1／3．1／2。 2 4核酸定量实验取上述样本进行荧光定量PcR测定，反应条件为预反应50C2min，预变 性94℃5 7 59+7，75E+6，75E+5，7 5E+4copies／ml。以测定的ESVDNA最高含量为基数，计算各种提 取方法的提取效率。 25统计学分析：测定结果统一换算成copies／ml取均值并转换戒对数，以提取效率最高的核 酸提取方法为基敷100％，其他方法与其相对百分比作矩型图比较。 3结果 3 1核酸提取方法的影响： 测定结果取平均值后换算成对数，加热裂解法测定结果为079．NP40加热裂解法测定 结果为7255，沉淀加热裂解法铡定结果为7956。以沉淀加热裂解法为基数100％，财加热 裂解法为85％，NP 40加热裂解法为91％。 3 2离心机转速的影响： 离心时用TG卜16c高速台式离心机HBVDNA定量结果为7956．用TGL一16G—A型高 速冷冻离心机时HBVDNA定量结果为8．552，定量结果以TGL—16G—A型高速冷冻离心机为 基数100％，则用TGL一16C高速台