杂交瘤细胞制备单抗过程中的低血清驯化和透析袋培养研究.pdfVIP

杂交瘤细胞制各单抗过程中的 低血清驯化和透析袋培养 顾铭吴萍戚艺华 (中国科学院生化工程国家重点实验室 北京 100080) 辅要杂史瘤细胞培养液中的牛血清引八了如：牛血清白蛋白、巨球蛋白，转杖蛋白等杂蛋白，使得 生成曲单抗堆咀分离纯化．逐步降低细胞培养澶中的血清浓度，使细月包主妻应于低血清培养，井洲定不 罔血清浓度下■胞的生长情况．杂交瘤细胞可雌在墙养95天后适应于在舍2％牛血清的培养洼巾稳定 培养，低血清培养对生成的抗体效价基皋没有影响．表明杂变癯细胞可以适应于低血清培养．为解头 培养上清中单抗浓度较低的p；q题．尝试在进折袋中培养低血清适应的杂交瘤细胞制备单克隆抗体，此 法使秤■胞密度比常规培养高8倍，单抗墓／Jt有明显提高． 关键词杂交瘤■胞；低血清适应性；透析袋培养 1前言 起始于七十年代的B淋巴细胞杂交瘤技术．在这--=十年中有了巨大的发展，可用于制备 针对各种抗原的单克隆抗体，并伴随产生了制备双功能抗体、抗独特型抗体、抗体酶等特殊功能 抗体的技术．随着基因工程技术的发展和应用，又产生了嵌合抗体、改型抗体、小分子抗体及完 全人源化抗体等基因工程抗体。90年代全世界仅单抗试剂盒的年产值就达20亿美元．预计到1999 年底可上升至60亿美元…． 但杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体用于对人类疾病进行治疗时遇到了两个主要问题：一是细胞 培养液中的牛血清成分复杂，很难分离提纯，易引起人的超敏反应；二是单抗浓度较低．使纯化 分离的成本较高。所以首先进行了杂交瘤细胞的低血清适应，继而尝试了在透析袋中培养杂交瘤 细胞以提高培养上清中的单抗浓度。 2材料和方法 2．1 实验材料：杂交癌细胞：由本实验室与中国医药研究开发中心共同制备的鼠-鼠杂交瘤细胞． 物技术公司． 2．2细胞计数方法：台盼蓝染色，结晶紫染色口】． 2,3抗体效价检测：用酶标试剂盒检测． NaHC03中洗涤两 2．4透析袋的处理方法：透析袋处理方法：在50％乙醇中洗涤两次；在10raM 次：在lmMEDTA中洗涤两次；最后用蒸馏水洗涤两次：每次洗涤持续2h，透析袋沸水煮 2h灭菌pI． 3结果与讨论 3．I杂交瘤细胞的低血清适应曲线： 杂交瘤细胞复苏后．用含25％胎牛血清的培养液培养两代；之后逐渐降低血清含量为： 续降低血清浓度． ∞ ；： ，、25 苎∞ 三： 蓑15 翟∞ 艇10 葺5 蚕： 0 O 0 i0∞册40∞∞7。∞帅 l 2 3 4 5 适由悯(d) f骸 圈I细胞的低血清适应曲线 图2细胞在l％血清浓度的培养液中培养5代 由图l可见，细胞随着血清浓度的降低，适应新血清浓度所需的时间不断增加。当血清浓度 降低至2％时．细胞可以稳定培养6代。当血清浓度降低至1％时，细胞可以培养5代，但从第一 次传代起死细胞的比例就比较高，达10％，至第4代，死细胞比例大于50％，表明细胞不能在1％ 血清浓度的培养液中稳定培养。杂交瘤细胞无血清培养在本文所述条件下无法完成。 3．2不同血清浓度细胞生长曲线： 由图3可见，杂交瘤细胞生长分为四