棉铃虫AFLP技术体系的建立研究.pdfVIP

棉铃虫AFLP技术体系的建立 牛宝龙翁宏飚孟智启 (浙江省农业科学院蚕桑研究所，杭州310021) 摘要：对影响棉铃虫AFLP技术体系的多种因素作了探讨，得到了一种适于棉铃虫AFLP技 术的优化体系。该体系中各优化因素为：①模板DNA浓度为150n∥仙L；②酶切体系中， BamHl币llXba l各加入5units，反应时间为2h；③连接最适反应时间为10h；④连接产物最适 稀释倍数为1o倍；⑤预扩增产物最适稀释倍数为lo倍。 关键词：棉铃虫；AFLP；影响因素 AFLP(AmplifiedFragmentLength FragmentLength Chain Polymorphism)和PCR(Polymerase 比，具有很多优点：多态性丰富、不受环境影响、带纹丰富、DNA用量少、无需预知基因组的序列 信息、稳定性好、多态性检测效率高12／。因而，AFLP自问世以来已被广泛应用于生物多样性研究剐， 指纹图谱构建M，遗传图谱构建c7l，基因定位【8】等诸多研究领域。近几年来，在玉米[31、小麦[41、大麦Ⅲ1 等作物中，利用此项技术进行研究的报道已有很多。但是，在棉铃虫上利用该技术进行相关研究的报 道还很少见。因此，建立一套适合于棉铃虫的优化的AFLP技术体系对于进一步深化棉铃虫分子生 物学研究具有重要意义棉铃虫(Helicoverpa World，包括亚洲、欧 armigera)是发生在东半球(Old 洲、非洲和大洋州)许多国家农作物的重要害虫，因其有寄主范围广、繁殖能力强、种群能远距离 迁移和对环境适应力强等特点，条件适宜时常大面积暴发成灾，造成棉花、玉米、花生、豆类、蔬 菜、花卉等的严重损失，其中以棉花遭受的损失最大。80～90年代，棉铃虫先后在东南亚、南亚和 东亚的多个国家大发生。 我国是世界植棉大国，总产量位居世界首位，植棉业是农业的支柱性产业，对国民经济的发展 至关重要，尤其是对纺织业的影响。1992年棉铃虫空前的猖獗，使全国上下为之震惊。在对棉铃虫 问题深为关切的同时，人们纷纷提出各种各样的问题。迫切希望我国植物保护研究、相关的研究部 门及推广部门提出控制棉铃虫灾害的有效办法，以保证我国棉花生产稳定发展。 1．材料与方法 Du640分光光度 述方法[9】进行。用0．8％琼脂糖凝胶检测RNA的有无并估计DNA的浓度，用Beckman 计检测DNA纯度与浓度，最后调整DNA浓度为150ng／lxL，AFLP扩增产物经1．5％的琼脂糖凝胶电泳 后用EB染色。BamHl、Xba l、T。ligase和Taq酶均购圭tTaKaRa公司。 2．结果和分析 2．1影响棉铃虫AFLP体系的因素 2．1．1模板DNA的纯度与用量 对于AFl』P而言．模板DNA的制备是非常重要的一个环节。模板DNA制备的好坏直接关系着试 一30— 验的成败。棉铃虫幼虫在冰浴条件下研磨后，用饱和酚抽提两到三次，再用氯仿一异戊醇(24：11多 次抽提、用RNA酶去除RNA，再经无水乙醇多次洗涤，最终保证获得高质量的模板DNA。经测定， 感，本研究表明，DNA用量从300ng至750ng，甚至更高或更低都对结果没有太大影响。 2．1．2酶切时间与酶切体系 为了确立适合棉铃虫的酶切时间与酶切体系，本研究作了不同处理试验。酶切时间分为1．5、 2、3h 3个处理。结果发现酶切2h的效果最佳，在进行0．8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA酶切片段时， 可见到在溴酚兰指示带上下均呈明亮的连续一片(smear)。少于2h，酶切不充分影响以后各步结果， l和Xba 而酶切时间过长，又延长了整个试验周期，降低效率。BamH l双酶用量应视所购BamHl和 Xba l和X