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中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集
产单核细胞李斯特菌的分子鉴定与亚分型研究+
周晓辉 焦新安
(扬州大学生物科学与技术学院，江苏扬州225009)
产单核细胞李斯特菌(Listena
及老年人等免疫缺陷人群的脑膜炎以及孕妇的流产。李斯特菌病被WHO列为4种主要的食源性疾病之一。
常规的李斯特菌检测时间长、鉴定程序烦琐、不利于快速诊断。另外传统的分类方法，如血清分型、噬菌
行病学研究。近年来，国外埘分子鉴定与分子亚分型技术已初步建立，但国内类似的工作开展较少。本
研究的目的是要建立一种能快速鉴定口M的方法，并建立一套以DNA序列为基础的分子亚分型体系，以
便快速确定食品的污染来源，并为进一步研究三M群体遗传学、流行病学及生态学奠定良好的技术基础。
1．材料与方法
和I株西尔李斯特茵(L
培养，挑取典型的单个菌落供PCR检测。
1．2三M的PCR鉴定与actA基因片段扩增
1．2．1引物设计根据发表的三Mhly和actA基因核苷酸序列，设计并合成两对引物：
actA actA
Pl：5’一GCTGATTTAAGAGATAGAGGAACA
引物由宝生物工程大连分公司合成。
1
10min；弃上清液，用9卑1X缓冲液
过夜；取250ul过夜培养物加入Eppendod管，13000r／min
荡数秒钟；58℃孵育，直至茵液变清；95C]JII热8min，使酶失活；离心取上清液备用。
1．2．3 PCR反应 1，10×缓冲液为2．5q1，
My基因扩增体系为2印1，其中dH20为16．5ha
Mgcl2(25mM)为I．5q l，
教育部“高校青年教师奖”资助(175)
344
中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集
系为10中1，其中actAP1和actAP2(12．5um)各4uL
×buffer为1ql，dH20为66．年l，Taq酶为0．8q
PCR产物进
行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪上观察结果，剩余的PCR产物用于直接测序。
1．2．3
梯度稀释，取每个稀释度的DNA进行PCR扩增，电泳后观察条带的亮度，直到不出现扩增带为止。
I．3核酸序列的分析应用MEGA2．0
进行序列同源性比较。
2．结果
2．I
而沙门氏菌、大肠杆菌、英诺克李斯特茵，格氏李斯特菌和西尔李斯特菌均呈阴性结果，未出现相应的片
液，用紫外分光光度计测得原液中DNA
表124株洲和5株非厶{，的hly基因PCR检测结果
TablelTheresultsof24LMand5non-LMdetectionPCR
by assaytargetinghlVgene
蜻号123456789101112131415161718192021222324SalmonellaEColiLinnocuaL L
grayiseeligeri
时粜++++++++++++++++++++++++． ． ． ． ．
时有较暗的条带，表明该PCR扩增体系能检测出6．5pg的厶MDNA(如图1所示)。
2．2
杆菌、英诺克李斯特菌，格氏李斯特菌和西尔李斯特菌未出现相应的扩增片段。
2．3actA
2．4
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