PCR方法在性病检测中的应用.ppt

PCR方法在性病检测中的应用;性病实验室涉及许多学科：主要技术为：1.镜检 NG,滴虫等 2.培养 NG UU 3. 血清学 SY 4. 酶免疫学检查 CT HSV HIV 5. 分子诊断技术 各种性病病原体;利用基因检测方法对各种传染病进行病原学诊断，是近年来的主要进展之一。它的优点是极大地提高了检测的敏感性。比如，在检测标本中只有一个基因拷贝存在时也可以用聚合酶链反应（PCR）或连接酥链反应（LCR）检测出来。其次，分子生物学方法可以诊断那些培养困难的病原微生物，如HPV感染。此外，它还可以用来进行流行病学，发病机理及药物治病监测的研究等。 ;由于PCR等对基因检测的高敏感性，近几年来，国内外的实践说明，实验过程中的带转污染造成的假阳性率甚高，临床标本的成分或在标本采集、运送和处理过程中介入外源性干扰物抑制了扩增所造成的假阴性也是常见的，因此实验条件要求十分严格，需在以下几个方面不断完善和控制： ;1．实验室设置：应有3~4间严格封闭独立的PCR前区、PCR后区和检测区，各区内衣、物和实验用具等互不交换；日常工作流程：工作人员先后顺序由前区进入后区，再进入检测区，不能逆转，检测区DNA污染最严重，应尽量远离的两区。试剂制备和标本处理应在生物安全箱（超净台）内进行。 ;2．各种类型标本的采集、储存、运送以及实验前的妥善处理，以减少污染、排除抑制剂和干扰物，必须不断探讨。 ;4．扩增产物的灭活：工作前后或发现污染可能时应及进行消毒清洁和紫外线灭活DNA。其次对扩增产物用酶灭活，光化学灭活，稀盐酸浸泡等处理清洁实验室及废弃物，力求减少污染。 ;;1996年底，在广东召开的全国性病学术交流会上，有关专家强烈呼吁：在目前条件下，不要滥用PCR作性病诊断，并规定不准用PCR实验结果报病。1998年4月15日卫生部卫医发[1998]第9号文件，发出，《关于暂停临床基因扩增（PCR）检验的通知》，明确规定“各医疗机构不得使用未经正式批准的试剂且不得以任何形式向患者收取费用”。目前多数医疗单位已停用PCR检查性病，并正探索按国际NCCLS分子诊断方法使用规则进行PCR质量控制，完善实验条件，提高准确性。 ;现将国内外基因检测在性传播疾病实验诊断的进展情况介绍如下: ;PCR的基本原理是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分三步： ;①变性（denaturation）,通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。②退火（annealling）,当温度突然降低时由于模板分子结构较引物复杂的多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。③延伸（extension），在DNA聚合酶、4种脱氧糖核苷三磷酸底物及Mg++存在的条件下，5’→3’的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，以上三步为一个循环，每一个循环为下一循环的模板。数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2×106拷贝。 ;;PCR法用于临床诊断的瑕瑜互见。它的优点敏感性高，不需放射性核素标记，以检测不能培养的病原体。但是，它所需的仪器设备和试剂在一般实验室尚不能配备。更重要的是，实验过程中有可能因外界污染而出现假阳性结果。因此，严格无菌操作、选用高纯度试剂及设制对照是保证试验成功的必要条件。 ;1．沙发衣原体的PCR检测 PCR法诊断泌尿生殖道沙眼衣原体感染的敏感性高，有时在细胞培养阴性者也能检测出沙眼衣原体感染。在一项比较研究中，PCR、培养和Gen-probe的敏感性分别是95%、86%和65%。另一项研究中PCR特异性达到100%。一种PCR（以不同的质粒DNA顺序为引物）证实，说明可能并非是PCR的假阳性结果。然而，也有报告由于累积性污染而造成PCR阳性，或因标本中含有抑制衣原体生长的物质或衣原体失活而致培养假阴性。因此，PCR的结果还应该结合临床病史和治疗情况进行分析，必要时重复取材或在另一部位取材作试验。 ;PCR法还可用于检测其他类型的沙眼衣原体感染。如沙眼，用直接免疫荧光法检查一组儿童，阳性率为22%，而PCR为48%。也有报道用PCR法检测精液、急性附睾炎或Reiter病中的沙眼衣原体感染。 沙眼衣原体PCR法已有商品化试剂盒（Amplicor,Roche Molecular Syetems）。此法扩增位于衣原体隐蔽性质粒中的DNA序列，扩增片段大不上为207个碱基对。这个试剂盒检测泌尿生殖道沙眼衣原体感染的敏感性达78.8%/~98.6%，特异性达99.7%~100%。 ;4．HPV感染的PCR检测 PCR检测HP