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双荧光素酶报告系统 作者：windyrain 2008-05-29 21:54:33 标签： 杂谈 双荧光素酶报告基因测试 ∶结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因 测试技术 在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时 ,通常采用第二个报告基因来减少实验的 变化因素。但传统的共报告基因(比如 CAT,β-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测 试化学,处理要求,检测特点存在差异。Promega 提供一种先进的双报告基因技术, 结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。双荧光素酶报告基因测试 系统,结合 pRL 载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行 双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。系统还提供 PLB 裂解液,用来裂解在 多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。对于正在使用萤火虫荧光素酶报 告基因载体的研究人员。双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系 统的便利。 介 绍 双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测, 通常一个报告基因 作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双报告基因通常 用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作 为对照的第二个载体。通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的 结构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改 变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测 试不被实验条件变化所干扰。 通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细 胞的数目和活力的差别, 细胞转染和裂解的效率。 使用萤火虫荧光素酶,结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄醛酸糖苷酶(GUS) 的双报告基因,近几年已普遍使用。但这些双报告基因 组合削弱了荧光素酶操作的优势 , 比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行, 但CAT, β-Gal 和GUS 测试法, 则在定量前需要长时间的保温。另外,这些报告基 因受限于它们的灵敏度和线性应答范围, 必须注意不要超过这些范围, 内源性细 胞活力也会干扰这类报告基因的使用。许多类型的细胞有内源β-Gal 或GUS 表 达, 不利于准确定量报告基因表达, 胞内去乙酰酶活力干扰CAT 活力测试。尽管 在高温下预处理细胞裂解液(1,2), 会降低内源性 β-Gal 和 CAT 测试的干扰，但 这些处理也会快速失活荧光素酶。因此,在此类双报告基因检测中, 必须以不同的 步骤分别处理共转染的细胞裂解液。 理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶所具有的速度,灵 敏和线性范围对同一样品中的两个报告基因同时测定。这在传统的报告基因, 如 CAT, β-Gal 和GUS 是不可能的, 由于它们测试化学,处理要求所固有的局限。相 反 , 结合萤火虫 ( Photinus pyralis ) 和海洋腔肠 ( Renilla reniformis ) 双荧光 素酶， Promega 的双荧光素酶报告基因测试 (DLR) 系统可满足这些要求，在 单管中完成这些测试。 双荧光素酶报告基因测试化学 荧火虫和海洋腔肠荧光素酶都具有生物发光报告基因的卓越的测试特点 , 但 它们在进化上的起源不同 , 因此 , 具有不同的酶学结构和底物要求。这些差别 用来发展了 DLR 测试化学 , 选择性地区别这两种发光报告基因的活力。萤火 虫荧光素酶是一个 61kDa 单亚基蛋白质 , 酶活力不需翻译后修饰 (3,4), 在翻 译后即可作为遗传报告基因。在 ATP,Mg 2+ 和 O 2 存在下，通过甲虫荧光素 的氧化反应发光 ( 图 1) 。在常规反应条件下 , 荧光素的氧化发生时 , 以荧光 素 -AMP 作为中间体 , 转换非常缓慢。结果 , 在底物和酶混合后 , 测试化学 产生闪烁的光 , 并迅速衰减。专利化的测试试剂 , 定量萤火虫荧光素酶活力 , 掺入了辅酶 A(CoA), 增