96孔板比浊法胰脂肪酶抑制剂体外筛选模型的建立研究.pdfVIP

96孔板比浊法胰脂肪酶抑制剂体外筛选模型的建立 姚 朗1 苏 勇2 蒋华良2 1广州军区联勤部药品仪器检验所 广州 5105002中国科学院上海药物研究所创 新药物研究室 摘 要 目的 建立灵敏可靠 简单易行 实用性强的胰脂肪酶抑制剂体外筛选模型 方法 采 用96孔板比浊法 选择临床注射用静脉脂肪乳剂Intralipid作酶活性测定底物 测定 1 静脉脂 肪乳剂的稳定性 2 胰脂肪酶对静脉脂肪乳剂的水解 3 奥利司他对胰脂肪酶活性的抑制 4 BSA对奥利司他抑制胰脂肪酶活性的影响 结果 1 该静脉脂肪乳剂稀释500- 1 000 倍后性质依然 稳定 可用作胰脂肪酶活性测定底物 2 胰脂肪酶可水解此乳剂底物 引起浊度下降 其速度随加 入酶量的增加而加快 3 阳性对照药奥利司他 orlistat 可抑制胰脂肪酶对此静脉脂肪乳剂底物的 水解 并呈现良好量效关系 4 蛋白成分 BSA 对奥利司他抑制胰脂肪酶活性的作用影响不大 结论 采用Intralipid 作乳剂底物所建立的96 孔比浊法胰脂肪酶测定方法灵敏可靠 简便易行 是体 外筛选胰脂肪酶抑制剂的良好模型 关键词 胰脂肪酶 静脉脂肪乳剂 比浊法 胰脂肪酶抑制剂 奥利司他 96孔板比浊法胰脂肪酶抑制剂体外筛选模型的建立 1 2 2 姚 朗 苏 勇 蒋华良 1 2 广州军区联勤部药品仪器检验所 广州 510500中国科学院上海药物研究所创新药物研究室 肥胖是一种受多种因素影响的脂代谢紊乱性疾病 肥胖及其相关疾病正日益威胁人类的健康 研制开发安全有效的减肥药物不但具有明显的医学价值 也有重要的社会意义和巨大的经济价值 胰脂肪酶 Pancreatic lipase, EC 3.1.1.3为脂肪从消化道吸收的关键酶 胰脂肪酶抑制剂 可抑制该酶活性 减少食物中脂肪的分解和吸收 达到控制肥胖 调节血脂 防止肥胖相关疾病危 险的目的 常用的胰脂肪酶活性测定方法难以制备稳定性好的乳剂底物 因此重复性差 误差较大 本研究拟采用96孔板比浊法 选择临床注射用静脉脂肪乳剂作酶活性测定底物 建立适合于筛选胰 脂肪酶抑制剂的体外活性测定模型 材料 试剂及仪器 注射用静脉高营养脂肪乳剂英脱利匹特 Intralipid华瑞制药有限公司产品 批号0012162-1A猪胰脂肪酶 VI-S型 lot S199020007和二甲亚砜 DMSOSigma产品 牛血清 白蛋白 BSA上海实生细胞生物技术有限公司进口分装 奥利司他 orlistat标准品(lot S199020007),上海罗氏制药股份有限公司 BIO-RAD 550型酶标仪 FA1104型电子天平 方法 胰脂肪酶酶活性测定方法 采用96孔板比浊法,试验分4组 空白对照孔 加酶对照孔 加药对照孔 加药试验孔 各3复孔 空白对照孔加100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0) 10ìl DMSO 10ìl 加酶对照孔加不同浓度(160-320 u/ml)的胰脂肪酶 10ìl DMSO 10ìl 加药对照孔加溶解 于DMSO的不同浓度待测药物10ìl 上述缓冲液 10ìl 加药试验孔加同样浓度的药物10ìl 胰脂 肪酶 10ìl 各孔加用上述缓冲液1:500-1:1000稀释的底物乳剂180ìl 置BIO-RAD 550型酶标仪 于不同时间测定 490 nm的OD值 用随酶标仪配备的MPM软件记录测定结果 静脉脂肪乳剂的稳定性 取1:10001:8001:600稀释的静脉脂肪乳剂各200ìl于96孔板 均8复孔 于0 0.52 4和8小时分别测定450 nm吸光度值 计算浊度下降值及下降百分率 胰脂肪酶对静脉脂肪乳剂的水解 分别配制 4个 1:600稀释的静脉脂肪乳剂 各加不同浓度 80-640 u/ml的胰脂肪酶10ìl DMSO 10ìl 测定并与对照孔比较乳剂底物随时间的浊度变化 奥利司他对胰脂肪酶活性的抑制 配制1:600稀释的静脉