Native-实验方法与问题及其解答主要内容分离酸性蛋白步骤.doc

Native实验方法分离酸性蛋白 分离碱性蛋白 问题和解答 非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。酸性蛋白通常在非 变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。 分离酸性蛋白 工作液配制 1. 40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）； 2. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4 贮存； 3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6 g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4 贮存； 4. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase， 144 g 甘氨酸，加水定容到1l ，4 贮存； 5. 2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，0.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O； -20贮存； 6. 10%APS； 7. 0.25%考马斯亮蓝染色液:Coomassie red R-250 2.5g，甲醇450ml，HAc 100ml, dH2O 450ml； 8. 考马斯亮蓝脱色液: 100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O 电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正） 1. 碱性非变性胶????? 17%分离胶(10 ml)?????? 4%堆积胶(5 ml) 2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C）?? 4.25ml?????? 0.5ml 3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)?????? 2.5ml 4. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)?????? 1.25ml 5. 水???? 3.2ml 6. 10%APS 35 μl 7. TEMED??? 15 μl 8. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到1L 电泳条件 :100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。 染色和脱色:取出胶板于0.25%考马斯亮蓝染色液中染色约30min，倾出染色液，加入考马斯亮蓝脱色液，缓慢摇动，注意更换脱色液，直至胶板干净清晰背景。也可以用银染或者活性染色。 分离碱性蛋白 要用低pH凝胶系统，并使用以下缓冲液体系： 1. 分离胶：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7% T，2.67% C）； 2. 堆积胶：0.06M KOH，0.063M Ac，pH6.8（3.125% T，25% C）； 3. 电泳缓冲液：0.14M 2-丙氨酸，0.35M Ac，pH4.5 将正负电极倒置，用甲基绿（0.002%）为示踪剂 实验操作同分离酸性蛋白。 回收 native结束以后，采用电泳的方法进行回收，方法如下： 电泳结束以后，切取部分染色，然后根据染色结果切取含有蛋白质的胶带装入处理过的透析袋中，加入适量的缓冲液，最后把透析袋放入普通的核酸电泳槽中，并在电泳槽中加入适量的缓冲液（和透析袋中的缓冲液相同），低温电泳2-3小时即可。回收蛋白所用的缓冲液一般和电泳所用的缓冲液相同。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native)的分类有三种常用的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法：blue native（BN），clear native（CN），quantitative preparative native continuous（QPNC）。 在一个典型的native PAGE方法中，复合物被CN或BN分离。然后可以用其它分离方法如SDS或等电聚焦做进一步分离。随后切割凝胶，蛋白复合物每一个部分都被分开。蛋白的每个条带可以消化后做肽链指纹图谱或重新测序。这样就可以提供一个蛋白复合物中单个蛋白的重要信息。 1. Blue Native PAGE Blue Native PAGE是最古老的Native技术。是以考马斯亮蓝作为电泳分离后蛋白