LCMS用于肌酸长期使用的细胞毒性机理研讨.pdfVIP

第24卷增刊 分析测试学报 V01．24 2005年11月 ofInstrumental !兰翌兰!竺垦!坚!墨型里PAO(Journal Analysis) NOV．2005 LC—MS用于肌酸长期使用的细胞毒性机理研究 王 琳，庄力霞，张耀阳，牟晓玲，肖盛元，邓玉林+ (北京理工大学生命科学与技术学院，北京100081) 肌酸(creatine)结构为N一甲基胍基乙酸(methylguanidinoaceticacid)，相对分子质量131，是磷 酸肌酸的前体物质，可明显提高短时间爆发性运动能力及运动耐力。长期以来，人们一直认为肌酸 是一种安全有效的营养补充品，直到最近有报道指出，怀疑个别举重、摔交运动员的猝死与其长期 大量服用肌酸有关，认为尽管短期服用肌酸不会对生命健康产生不良影响，但长期大量服用肌酸会 对细胞造成一定的毒性伤害。 amine 肌酸在生物体内可以代谢为甲胺，甲胺作为SSAO(semicarbazied—sensitive oxidases对氨 基脲敏感的氨基氧化酶的通称)的底物，可进一步被催化生成甲醛、过氧化氢和氨，这些都是具有 细胞毒性的物质。本实验以研究肌酸的负面效应为出发点，通过观察小鼠El服肌酸2个月内尿液中 甲胺和甲醛的含量以及血清中SSAO活性等指标来探讨长期服用肌酸对细胞造成的毒性伤害。其中 SSAO活性的测定方法是高效液相色谱与质谱联用法，该法为我们实验室首创。 1 实验部分 1。1试剂与仪器 生化纯肌酸粉购自康比特威创体育新技术发展有限公司。OPA，DNPH，异丙胺，2一溴乙胺购自 Sigma公司。乙腈，甲醇为色谱纯，购自Fisher公司。其它试剂均为分析纯。 1100LCMSD 主要仪器为Agilent TrapMS，Waters474荧光检测器。 1．2 动物处理 二级昆明小鼠，雄性，体重18～20 g，购自北京大学医学部实验动物科学部。随机分成7组， 分别为对照组；低、中、高3个不同剂量服用肌酸组；以及相应的加SSAO抑制剂(2．溴乙胺)组。 低、中、高3个剂量组所用肌酸量分别相当于人服用肌酸保持量5g／a的等效、保持量5g／d的5 倍、冲击量20 h g／d的10倍。实验期间小鼠自由进食，12light／dark，20oC。 1．3样品处理 代谢笼收集不同实验组小鼠24h尿样，代谢期间小鼠禁食，但自由饮水。尿液收集瓶用干冰冷 浴，置于聚苯乙烯泡沫塑料盒中，记录所取尿样的总体积，于一70℃保存。取小鼠尾静脉血约 0．2 500 mL／只，2 g，4℃冷冻离心20min，取上层血清于一70℃保存。 1．4方法 mm×250 色谱条件：DiscoveryF5-SH柱(4．6 mm，5斗m)，20％(9)乙腈一水的流动相(pH 4．0)，流速0．8mL／min，进样量20灿L。质谱条件：ESI源，正离子模式，一级质谱做全扫描，扫 描范围m／z160—220，提取m／z I／ 170的离子流色谱图。雾化气压力为28psi，干燥气流速为8 nm。 min。用考马斯亮蓝比色法测蛋白质浓度，检测波长为595 1。5 SSAO活性的测定 标准甲醛溶液中加入40mg多巴胺，于0．05 6．8)体系37℃反应 mol／L磷酸盐缓冲液(pH 30 min，PCA终止反应。以异丙基肾上腺素为内标