实时定量PCR检测IgH基因重排的研究.pdfVIP

指导小组成员 段勇 主任医师 张学美 副主任医师 王玉明 副主任医师 第一部分 改良SYBRgreenIRQ--PCR定量检测DN^方法的建立 研究生:石岚 导师: 李惠民副教授 李维佳 教授 摘要 目的探讨用改良SYBRgreenI实时定量PCR(RQ-PCR)技术，消除引物二聚体((PDs) 对定量分析的影响，建立准确的定量检测DNA含量的方法。 方法 以0-actin为目的基因，通过对扩增产物和PDs熔解曲线的分析找出各自的解链 温度 (TM),选择在高于PDsTm但低于目的片段TM的温度时检测荧光信号，建立改良 SYBRgreenIRQ-PCR方法。用此法构建了标准曲线，并检测了该法用于DNA定量的精 确性和稳定性。 结果该法可消除PDs对SYBRgreen1实时定量PCR的影响。所得标准曲线斜率为 -3.178866，相关系数为一0.980535,PCR反应动力学范围达5个log值 (102-106);精确性 检测中，DNA含量实测值与预侧值的差异无显著性 ((P0.05);稳定性检测中，三种不同 浓度标本的批内变异和批间变异分别为1%,3%,2%和2%,4%,4%0 结论 改良SYBRgreenI实时定量PCR可有效消除PD:对定量分析的影响，对目的基 因DNA拷贝数进行PCR反应线性范围广、敏感性高、精确性佳、稳定性好的定量检测。 是一种简便实用的DNA定量检测的方法。 关键词:SYBRgreenI实时定量PCR弓】物二聚体DNA定量 Part I QuantificationofDNAusnigimprovedSYBRgreenIRQ-PCR Postgraduate: ShiLan Academicsupervisor:Associateprof.LiHuiming Prof.LiWeijia Abstract ObjectiveToinvestigateusingimprovedSYBRgreenIrealtimequantitativepolymerase chainreaction(RQ-PCR)technologytoeliminatethecontaminatingfluorescenceinducedbythe primerdimers(PDs),inordertoestablishmoreprecisequantitaionofsampleDNAcontent. MethodsThetargetgeneis13-actin.wecouldestablishtheimprovedSYBRgreenIreal timequantitativePCRbymeasuringfluorescenceatatemperaturegreaterthanthemeltingpoint ofPDsbutlowerthandesiredgeneafterobtainingthemeltingtemperature(Tm)ofdesiredgene andPDsbyanalyzingthemeltingcurve.Standardcurvewasconstructedbyusingthisway. Accuracyandstabilityofthisimprovedtechnologywerestudied. Results