临床基因扩增检验操作规范PPT.ppt

3、改进实验操作： (1) 带一次性手套； (2) 避免反应液的飞溅； (3) 用一次性移液器或吸头，吸头不要暴露于 空气，以免产物气溶胶污染； (4) 操作多份样品时，要先将可混匀的成分 (dNTPs，缓冲液，引物等)一起制备标准 混合液(Master mix)； (5) 制备反应混合液时，最后加入样品DNA， 加入DNA后，在进行下一步操作前要盖紧 反应管。 4、检查结果的可重复性。 （二）污染源的追踪 1、阳、阴性对照 选择阳性对照时，应选择扩增弱， 且重复性好 的样品。 阴性对照的选择一定要小心。 不含模板DNA的PCR试剂对照。 2、常见的环境污染源有 (1) 点杂交的点样器； (2) 切片机； (3) 离心机； (4) 切胶用刀或微解剖刀； (5) 浓缩用具，真空瓶； (6) 电泳装置和紫外灯箱； (7) 干冰/乙醇或水溶锅； (8) 冰箱门把手、冷冻架和门把手。 追踪可疑的环境污染源 ① 用去离子浸湿的灭菌棉签擦试可疑部分 ② 在0.1ml 去离子水中浸泡； ③ 取5μl 作PCR反应； ④ 电泳检查结果。 （三）污染源的处理 1. 环境污染处理法 （1）稀酸处理法。 对擦试实验阳性部位或器件可用1mol/LHCl擦洗或浸泡残留DNA。 （2）紫外法： UV照射波长一般选择254/300nm，需考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布。UV对长片段（500bp以上）有效，而对短片段效果不大。 2. 反应液的污染处理法 (1) DNaseI法： PCR混合液（不加模板和Taq酶）中加入0.5U DNaseI，室温下作用30min后，加热灭活，加入模板和Taq酶后即可进行正常PCR。 优点：便宜，不需知道扩增DNA序列。 (2) 内切酶法： 选择识别四个碱基的内切酶（如MspI等），最好几种合用，可克服其识别序列特异的缺陷。方法同上，只是DnaseI由内切酶（MspI10U）代替，作用时间延长到1.0～1.5h。 (3) 紫外照射法： 反应中不加模板与Taq酶。 (4) 尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）法： dUTP代替反应中的dTTP，使产物中含大量dU，UNG可去除dU，使失去dU的位置，阻止Taq酶的延伸。PCR正常循环前，用UNG处理PCR反应混合液可消除PCR产物的污染，而UNG在正常PCR循环变性一步就会失活，所以，对含dU的新合成PCR产物没有影响 。 T A T A T A T A T A PCR A U A U A U UNG A A A 加热 A A A × PCR 该法优点： ① 去除任河来源（包括引物在内）的