凝胶电泳与应用.DOCVIP

崔景荣部分 4 PCR多聚酶链式反应技术 4.1 概述 通过耐热的DNA聚合酶，在生物体外进行的链式DNA合成反应，用于扩增特定的DNA片段。 应用：农业、生物、古生物学（分析标本）、动物学（遗传病学诊断）、法医学（现场标本分析）、医药（研究、诊断、基因工程） 4.2 PCR技术原理 PCR技术： 条件：原料——模板DNA、引物、4种脱氧核糖核苷酸，工具——DNA聚合酶，缓冲液环境 实质：体外的酶促DNA合成反应 反应步骤：变性（denaturation），退火（annealling），延伸（extension） 4.3技术操作程序 原料：ddH2O，缓冲液，dNTP，引物、DNA模板 过程： 混匀、离心(加石蜡油(冷致延伸温度(加TaqDNA酶(开始第一个循环反应 (重复反应循环25-30次(电泳检测扩增产物 循环反应：[变性：94℃，30s；退火55℃，30s；延伸：70-72℃，30-60s] 变性：利用约94℃的高温，使双链DNA分离，仅以单链形式存在。该步骤时间30s。 退火：降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度低于Tm 5℃：Tm = 4(G+C) + 2(A+T)，时间30s。 延伸：DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度一般约需72℃，合成2kbp大概需要1分钟。 4.4 PCR条件的优化 (1) 模板 来源：临床