干细胞移植对糖尿病后肢缺血大鼠骨骼肌中生长因子表达影响的初步研究.pdf

中文摘要 干细胞移植对糖尿病后肢缺血大鼠骨骼肌中 生长因子表达影响的初步研究 摘 要 目的：随着社会的发展和进步，人们生活水平的不断提 高和生活方式的改变，糖尿病患病率在我国乃至全世界范围 内呈逐渐上升趋势。糖尿病久病可引起眼、肾脏、神经、血 管等并发症，截至目前为止，关于糖尿病视网膜病变、糖尿 病肾病的研究，国内外报道的很多，但关于糖尿病的骨骼肌 病变，国内外研究的较少。骨骼肌是全身利用葡萄糖最重要 的组织之一，也是高血糖损害的主要靶位，高血糖和下肢缺 血两个因素共同引起糖尿病下肢骨骼肌病变。近年来，生长 因子在骨骼肌生长发育、肌肉内血管生成及肌肉损伤后修复 中的作用受到了越来越广泛的重视。 随着干细胞研究的进展以及分离、纯化干细胞方法的不 断改进，使采用干细胞治疗等治疗性血管生成方法在缺血部 位重建有效的侧支循环成为可能，目前临床上证实自体外周 血干细胞移植术是一种较好的治疗糖尿病下肢骨骼肌病变 的方法。 本研究通过给雄性SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素 动脉并离断制造糖尿病后肢缺血模型来复制糖尿病大鼠后 肢骨骼肌病变模型，通过对部分大鼠实施自体外周血干细胞 移植术，观察自体外周血干细胞移植术对后肢腓肠肌中血管 endothelial 内皮生长因子(vascular growth 中文摘要 fibroblast 碱性成纤维细胞生长因子(basic factor， growth bFGF)表达的影响，探讨自体外周血干细胞移植术对糖尿病 大鼠骨骼肌病变改善的情况，从而为临床上实施干细胞移植 治疗糖尿病骨骼肌病变提供理论依据。 方法： 1糖尿病大鼠模型的制备 后随机分为3组：正常对照组(A组)15只、糖尿病后肢缺 血组(B组)15只、糖尿病后肢缺血后干细胞移植组(C组) 血糖大于16．65mmol／L定为造模成功。 2糖尿病大鼠后肢缺血模型的制备 糖尿病造模成功后7天对糖尿病大鼠实施双后肢股动脉 结扎并离断造成糖尿病大鼠后肢缺血模型，后为预防伤口感 染，每天给予肌肉注射青霉素4万单位／只，共3天。在实验过 程中，B组大鼠死亡2只，C组大鼠死亡1只。 3干细胞动员 在糖尿病后肢缺血造模成功后第7天，C组大鼠开始每天 1 给予皮下注射粒细胞集落刺激因子0．CSF 5pg／kg，连用3天， 给药后第3天采集各组大鼠内眦静脉血进行白细胞数值监 测。 4实施自体外周血干细胞移植术 C组大鼠每只心脏采血5ml，加入抗凝管中，与Hank’S 液1：1混匀后，小心加于10ml的细胞分离液之液面上，以 2000转／分离心15分钟，收集界面上的细胞，放入含Hank’S 中文摘要 10分钟，吸去上清液，沉淀经反复洗2次即得所需细胞。用 lml无菌注射器抽取细胞，制成5x108／ml的细胞悬液，分别 在C组每只大鼠左下肢腓肠肌处多点肌肉注射。 5标本收集 干细胞移植后4周心脏采血，后处死大鼠，并留取每只 于10％的福尔马林中保存，待行HE染色观察三组病理结果， 行免疫组织化学染色测定后肢腓肠肌中VEGF及bFGF的表 达情况。 6观察指标 6．1血糖的测定 血糖用葡萄糖氧化酶法测定。测定步骤：准备3只试管： 空白管、标准管、测定管，均加入酶、酚试剂各1．5ml，标准 管加入标准液0．02ml，待测管加入待测样本0．02ml，混匀后于 37。C保温15分钟，以空白管调零，测定各管吸光度值。测 定参数：波长505nm，温度37℃。 6．2外周血白细胞的测定 取大鼠内眦静脉血lml，利用流式细胞检测仪进行白细 胞计