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多基因共表达载体的构建策略 曹慧青，丁金凤 国外医学（分子生物学分册） 2002 Vol.24 No.1  多基因共表达载体的应用 表达异源多聚体蛋白的亚单位，如免疫球蛋白、细胞受体、白细胞介素、转录因子等 同时表达针对同一靶细胞的几种异源蛋白以取得联合或协同的作用，如原癌基因、抗血管生成基因、自杀基因等。 策略一：多启动子表达载体 原理：带有各自独立启动子的多个表达盒构建于一个载体上，转录出多种不同的mRNA，并翻译出不同的蛋白。 优点：简便 缺点：①内部启动子占据载体上有限的克隆空间 ②启动子间相互干扰，造成不同基因的表达水平 不一致 策略二：剪切载体 原理：利用一个启动子，在外源基因两侧提供剪切供体/受体位点，通过剪切初始转录本，形成不同的mRNA，分别表达两个基因 缺点：可变剪切机制未明，双基因表达效率很不稳定 策略三：表达融合基因 原理：两基因用linker（多选择中性疏水氨基酸）或直接相连，使用同一开放阅读框，翻译产生嵌合的一个双功能融合蛋白分子 优点：翻译水平等量表达，常用于阳性/阴性双选择标记载体、筛 选标记/报告基因载体的构建 缺点： ①可能由于构像的改变使其中一个或两个基因的功能受到 影响 ②若两基因产物有不同的细胞定位，也会影响基因的正常 功能。也就是说表达平衡，而功能并不平衡 策略四：基因之间以IRES序列连接 原理：内部核糖体进入位点（IRES）序列来源于某些病毒和细胞的mRNA 5‘端的一段非翻译区。在上游启动子的控制下，该序列及与之相连的基因可同时转录，并以不依赖帽的方式启动远端mRNA的翻译，从而在同一转录本上翻译出不同的蛋白 优点：①克服了双启动子之间相互抑制的现象 ②简化了传统的双启动子表达盒模式繁琐的阳性克隆筛选 过程 ③可以拓展到构建双IRES序列三表达基因载体 不足：转录等量，翻译独立。以IRES启动的翻译效率较帽依赖的翻译效 率低。置于IRES下游外源基因的表达量是其上游帽启动翻译基因 的20%-50%。 策略六：基因之间以2A序列连接 原理： 2A是一种具有自我加工能力的蛋白酶，在不同病毒中它的长度、作用位点各不相同。 在口蹄疫病毒中的2A序列有长短两种类型，长型有201bp，编码39个氨基酸，短型有96bp，编码17个氨基酸。两者作用相似，均可独立的用于构建多基因载体。 将两基因分别克隆到2A序列的两侧，去除上游基因的终止密码形成单一的开放阅读框，翻译出的多聚蛋白可在编码2A区域的C末端被切割为两个蛋白，上游蛋白融合了2A的C端多肽，并释放出完整的下游蛋白。 2A与Furin的不同之处： ①2A的切割位点在自身C端最末位的两个氨基酸之间（甘-脯） ②切割作用伴随翻译过程完成 ③切割活性高达85%-99% 但是具体的切割机制不明 可用于与IRES序列一起构建多顺反子载体。研究表明两个近邻的IRES序列会降低基因的表达。因此，2A序列在构建多顺反子时是IRES序列的有益补充。