变性梯度凝胶电泳技术研究土壤微生物多样性研究.pdfVIP

摘要 变性梯度凝胶电泳技术研究土壤微生物多样性 摘 要 保持正常的土壤微生物群落构成及分布是维护农业生态系统稳定与健康发 展的基础。把分子生物学技术引入到微生物生态学研究领域，研究不同环境条件 下的土壤微生物群落构成及分布状况，可以更方便地了解农田土壤中微生物群落 组成和各种群之间的分布，从而获得全面的土壤微生物生态状况的信息。这对于 准确了解农田土壤资源生态状况、及时调整农业耕作结构、维护农业的持续发展 具有重要的意义。本文结合聚合酶链反应和变性梯度凝胶电泳 (PCR-DGGE)技 术，系统研究了我国不同地区土壤、农药及重金属污染土壤中微生物群落多样性 (主要研究细菌多样性)，对上述土壤的生态系统状况进行了初步评价。研究获 得了以下创新性结果: 1,PCR-DGGE方法体系的建立:首先直接从土壤样品中提取出细菌群落的 基因组DNA，纯化后以此DNA为模板，采用对大多细菌和古菌的16SrRNA基 因V3区具有特异性的引物对F357GC和R5is进行PCR扩增，将长约230bp的扩 增产物使用变性剂 (100%变性剂是7M尿素和40%甲酞胺的混合物)浓度梯度 为30%到50%的10%的聚丙烯酞胺凝胶进行分离，最后对电泳谱图进行分析， 得出其中细菌多样性的信息。 2,PCR-DGGE方法体系的优化:比较了GC发卡结构和三种不同的DNA 聚合酶tTaqDNA聚合酶、TsgDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶)对DGGE实验 结果的影响。结果表明，在进行PCR时，在正向引物的5端添加GC发卡结构、 使用保真性较高的PfuDNA聚合酶在使用PCR-DGGE研究细菌多样性中是非常 必要的。 3、我国不同地区农田土壤的细菌多样性评价:采用传统平板培养分离技术 和PCR-DGGE技术分别研究了取自13个不同地区的土壤中可培养细菌多样性和 细菌遗传多样性。结果表明，无论可培养细菌的多样性，还是细菌物种遗传多样 性，我国13个地区的土壤呈现很大的差异，这主要由于不同环境条件的影响所 致。在研究微生物多样性时，传统方法和分子技术的有机结合可以使研究工作更 摘要 加全面、准确。 4、农药污染土壤中细菌多样性评价:将陕西凤翔的农田土壤分别用乙草胺、 氰戊菊酷和甲基托布津处理后，研究其中的可培养细菌多样性和细菌遗传多样 性。结果表明:土壤中分别施加三种不同农药会对土壤中细菌多样性产生负面影 响，降低土壤细菌的多样性;同时，土壤中存在有一些细菌对土壤中外源化学品 (如农药)的降解具有一定的关系，DNA序列测定结果显示，这些细菌有可能 属于Pseudomonas属的某些种。 S、重金属污染土壤中细菌多样性评价:将辽宁沈阳的农田土壤分别用铅离 户和汞离子处理后，研究其，{，的可培养细菌多样性和细菌遗传多样性。结果表明: 汞离子会使原有土壤中细菌的多样性降低，具体表现在细菌群落的多样性指数(功 和丰度(S)指标均降低;铅离子会使土壤中细菌群落的丰度(S)降低，但物种遗传 多样性指数扔〔却有不同的增加，这主要与群落中每个个体的比率和分布发生明 显的改变有关。同时，研究发现，建立16SrDNA文库是对应用PCR-DGGE技 术研究细菌多样性的有效补充措施。 关键词: 细菌多样性，基因组DNA，聚合酶链反应，变性梯度凝胶电泳 16SrRNA基因，农药，重金属，16SrDNA文库 Abstract StudyofMicrobialdiversityinsoil勿DenaturingGradientGel ElectrophoresisTechnique HaifengLuo SupervisedbyProfessorHongxunZhangandHongyanQi Abstract Keepingthenormalconstitutionanddistributionofmicrobialpopulationsinsoilcan assurethestabilityand