神经型尼古丁受体α3亚单位沉默对SH-SY5Y细胞β淀粉样蛋白和凋亡的影响及其机制研究Effect of neuronal nicotinic receptor α3 subunit silencing on β-amyloid protein and apoptosis in SH-SY5Y cells and its mechanism.pdfVIP

贵阳医学院 2011 届硕士研究生论文 神经型尼古丁受体α3 亚单位沉默对SH-SY5Y 细胞β淀粉样蛋白和 凋亡的影响及其机制研究 生物化学与分子生物学研究生：张雪玲 导师：官志忠 教授 单可人 教授 摘 要 【目的】测定神经型尼古丁受体( Neuronal nicotinic acetylcholine receptor, nAChR) α3 亚单位mRNA 沉默后的神经母细胞瘤细胞(Neuroblastoma cell, SH-SY5Y) 中β 淀粉样蛋白（-Amyloid peptide ，Aβ ）含量、β 分泌酶两个亚型（Bace1 和Bace2) mRNA 和蛋白表达水平、细胞凋亡水平、凋亡相关通路P38 MAPK 及凋亡相关 分子（Bax 、Bcl2 ）含量，研究α3 nAChR 亚单位在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD ）发病中的神经保护作用。 【方法】选用稳定转染α3 nAChR siRNA 表达质粒的SH-SY5Y 细胞、空质粒对 照细胞和正常对照组细胞，用实时荧光定量PCR (Real-time PCR)和蛋白质印迹 方法（Western Blotting）检测α3 nAChR 亚单位mRNA 和蛋白表达水平；用双 抗体两步夹心酶联免疫吸附法（ELISA ）检测Aβ 含量；用 Real- time PCR 和 Western Blotting 方法检测细胞中β 分泌酶两个亚型（Bace1 和Bace2 ）mRNA 和 蛋白表达水平。用Aβ （10 μmol/L，48 小时）处理α3 nAChR 亚单位mRNA 沉 默后的SH-SY5Y 细胞、空质粒对照细胞和正常对照组细胞，用Annexin V–FITC 凋亡检测试剂盒，经流式细胞仪测定细胞凋亡水平；用Western Blotting 方法测 定P38 MAPK 通路中P38 蛋白表达水平；用ELISA 方法检测Bax 、Bcl2 含量。 【结果】与空质粒对照组及正常对照组细胞相比，稳定转染α3 nAChR siRNA 表 达质粒的SH-SY5Y 细胞中，α3 nAChR 亚单位 mRNA 及蛋白表达水平降低， A含量增加，Bace1 mRNA 和蛋白表达水平增加，Bace2 mRNA 和蛋白表达水平 减少。用Aβ 处理后，与空质粒对照组及正常对照组细胞相比，稳定转染α3 nAChR siRNA 表达质粒的SH-SY5Y 细胞中，细胞凋亡率增加，磷酸化P38 蛋白表达量 增加，而总P38 蛋白表达水平未见明显改变，Bax 含量增加、Bcl2 含量减少。 【结论】针对α3 nAChR亚单位的小分子干扰 RNA有效地抑制了培养细胞中α3 nAChR亚单位mRNA和蛋白水平的表达；α3 nAChR亚单位mRNA沉默可以增加 1 贵阳医学院 2011 届硕士研究生论文 Aβ生成，其机制可能与α3 nAChR亚单位mRNA沉默后增加Bace 1表达水平、减少 Bace2表达水平有关；α3 nAChR亚单位mRNA沉默可以增加Aβ 的致凋亡作用，其 机制可能与α3 nAChR亚单位mRNA沉默后增强凋亡相关信号通路P38 MAPK和 增加促凋亡相关蛋白Bax ，减少抗凋亡相关蛋白Bcl2等因素有关。结果间接表明α3 nAChR亚单位在AD发病过程中有一定的神经保护作用。 【关键词】α3 nAChR亚单位；β 淀粉样蛋白；β 分泌酶；凋亡；P38 MAPK信号 通路；凋亡相关调控蛋白 2 贵阳医学院 2011 届硕士研究生论文 前 言 阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease