兔椎间盘软骨终板细胞培养及其退变形态学和生物学特征的研究.pdfVIP

第四届全国解剖与临床学术研讨会暨‘解剖与临床》杂志创刊lO周年庆祝会论文汇编 兔椎间盘软骨终板细胞培养及其退变形态学和生物学特征的研究 屈开钛徐永清王非 成都军区昆明总医院骨科昆明650032 【摘要】目的：观察研究兔椎间盘软骨终板的细胞形态及表征，利用正常动物的体细胞传代培 养发生功能退变的原理，制作软骨终板细胞体外培养的退变模型。方法：酶消化法培养兔椎间 盘软骨一终扳细胞，并用HE和甲苯蓝染色，进行光镜观察；使用免疫组化法检测椎间盘的特征 性II型胶原表达情况，与同种动物不同部位的软骨细胞做对照。结果：镜下观察，HE染色见 细胞呈多角形，核为圆形或椭圆形，有时见双核，胞浆内可见空泡。甲苯胺蓝染色可见胞浆及 细胞周闱有紫红色或红色异染出现。原代细胞与传代细胞之间，形态结构无明显差异，但多次 传代后(4代)，细胞则逐渐火去其原有形态，变为短梭型细胞，失去分化特性，表达II型胶 原的量逐渐减少。软骨关节细胞与终板细胞形态学相似。结论：本研究提示(1)软骨终板细胞 可表达其特征性产物蛋白多糖和II型胶原；(2)软骨终板细胞在培养时有逐渐退变，失去分化 特性的特点，(3)在应用平面培养体系时应选用前3代细胞进行实验。以上几点均为椎间盘退 变机理研究提供了细胞学基础。 1具体方法 1．1主要试剂和器材 试剂：1，9--甲基Ⅱ甲蓝， cm2的培养瓶，24孔培养板等。 差显微镜， 高速低温离心机，血球计数极，50mi离心管，25 1．2兔终板软骨细胞的取材和分离纯化方法 取1月龄幼兔5只空气栓塞处死，常规手术消毒铺巾后取出兔整段腰椎，予无菌台上解剖山椎间 盘及周同椎体后浸入lOOU／ml链霉素的培养基中进行清洗。之后置于消毒灭菌后的4倍解剖显微镜下， 予椎间盘中份切开椎间盘，剔除髓核，刚眼科剪尽量剪除纤维环后，再用手术刀沿椎骨缘下取’卜剩余的 椎间盘。由于兔软骨终板比较薄，在取材时如果不小心操作的话，很容易将椎间盘中的其他结构(如纤 维环)当作终板取下。我们在实验中主要采取了如下两个步骤米避免取材的失误。1．在大体中切断椎体 后，将切断的椎体迮带中间的完整椎间盘浸入lOOU／ml链霉素的培养基中进行清洗，5分钟后取出，置 于消毒灭菌后的4倍解剖显微镜下，于椎间盘中份切开椎间盘，剔除髓核，用眼科剪尽量剪除纤维环后， 再刚手术刀沿椎骨缘下取下剩余的椎问盘。2．将剩余的椎间盘放入4cm直径的培养皿中，用手术刀切成 下来为标准，得到的基本上就是终板细胞了。而后经DMEM液稀释、200目钢丝网过滤组织块后得到细 胞悬液。将得到的细胞悬液800r／min离心5分钟，去除沉在底层的血球等杂质，之后反复吹打，得到 比较纯净的软骨终板细胞恳液。 1．3软骨细胞培养 mL／L胎牛血 取所需量的原代软骨终板细胞悬液，经适当稀释后，以3X104／cm2的密度、含100 ug／1维生索C的DMEM／ 清、584mg／L谷氨酰胺、0．1mmol／L--IF-必需氨墓酸、0．4retool／1脯氨酸、50 267 第四届全国解剖与临床学术研讨会暨‘解剖与临床》杂志创刊10周年庆祝会论文汇编 代80％融合时进行传代培养，膝关节软骨细胞培养方法同上。 1．4绘制细胞生长曲线 选取70％融合、生长良好的原代终板、膝关节软骨细胞及第3代终板细胞，用胰酶消化，制成细胞 悬液，行细胞记数，调整细胞浓度为1X 个培养孔的细胞进行计数，计算均值，连续观察16天，以培养时间为横轴、细胞数为纵轴，描绘细胞 生长曲线。 1．5 甲苯胺蓝年qlHE染色 溶液中4℃下，同定20min，分别做HE染色和甲苯胺监染色，镜下观察。 1．6II型胶原免疫组化