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生物技术专业实验讲义 食品与生物工程学院生物技术教研室 二 00 五年八月 目 录 实验一 植物组织培养中的无菌技术 实验二 愈伤组织的诱导 实验三 愈伤组织的分化 实验四 植物细胞悬浮培养 实验五 植物多倍体诱导及其细胞学鉴定 实验六 农杆菌的活化培养及介导的遗传转化 实验七 PCR 基因扩增 实验八 在大肠杆菌（E.Coli）表达蛋白产物 实验九 表达蛋白的分离与纯化 实验十 基因组DNA 文库的建立 实验一 植物组织培养中的无菌技术 一、目的要求 通过实验掌握植物组织培养中的无菌操作技术。学习培养基的配制及灭菌，掌握植物外植体表 面消毒的常规方法。 二、基本原理 近年来，植物组织培养作为一种研究技术已被广泛。植物组织培养是应用无菌操作方法培养植 物器官或组织地任何一部分，甚至单个细胞的观察。植物组织培养中的无菌技术主要包括培养基的 配制与灭菌。 1．MS 培养基的配制： 对植物外植体进行离体培养时，培养基提供生长所需的营养成分等。不同材料对培养基的要求 不同，适当地设计和选用培养基，对植物组织培养取得成功是至关重要的。另外，对组织培养物的 脱分化和再分化等状态的调控、次生代谢产物的生产等都是通过调节培养基成分来实现。培养基的 主要成分包括无机营养物、碳源、维生素、植物生长物质和有机附加物等。植物生长物质是培养基 中的关键物质，对外植体愈伤组织的诱导和分化起着重要的调节作用。 配制培养基通常都按配方浓度的若干倍称量，配制成一系列的母液置于冰箱保存，使用时按比 例稀释。一般要配下列母液：大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、植物生长物质母液、有机 化合物母液。 2．培养基灭菌： 凡是暴露在（未经处理的）空气中的物体，曾经接触过自然水源的物体都是有菌的。培养所用 的培养基含有植物细胞生长所必需的各类营养物质，也是各种细菌、真菌滋生繁殖的极好场所。组 织培养必须采用无菌技术，在取材、接种、培养的整个过程中，必须严格进行培养基和培养材料的 灭菌，同时，严格进行无菌操作，防止污染。 3 ．植物外植体消毒和接种： 用于进行组织培养的组织、器官和细胞称为外植体。在组织培养中，外植体如果是带菌的，在 接种前都必须进行表面消毒，这是取得培养成功的最基本的和重要的前提。常用消毒剂对外植体进 行消毒。从室外取的材料，一般先用自来水冲洗数分钟，对表面不光滑或长有绒毛等结构不容易洗 净的材料，自来水冲洗的时间要长，几个小时或过夜，并且用洗衣粉或洗洁精洗涤，必要时用毛刷 刷洗。洗后的材料用滤纸擦干，然后浸泡在消毒溶液中。接种材料使用消毒剂后，要用无菌水洗涤 3～5 遍，最后用无菌纸擦干净。使用消毒剂的原则是既要达到消毒目的，又不能损伤植物组织和细 胞，还要符合就地取材的原则。 对一些容易污染、较难灭菌的外植体进行表面消毒时，用单一消毒剂不能收到好的效果，所以 常选用两种消毒剂交替浸泡法。一般，首先用 75 ％乙醇浸泡外植体数秒钟至30s，然后置于 0.1 ％氯 化汞溶液 5～10min 或含有 2 ％活性氧的次氯酸钠溶液5～30min，然后用无菌水洗涤。有时在氯化汞 或次氯酸钠灭菌后，用无菌水洗，进一步剥去几层组织或器官如叶片后，再用次氯酸钠灭菌 3～5min， 无菌水漂洗 3 次后，切割、用于接种。 用消毒剂对接种材料进行灭菌处理时，可以在灭菌溶液中加入 1～2 滴表面活性剂，如吐温 80 或吐温 20 ，它们可以湿润外植体整个组织，促进灭菌液充分接触表面组织，达到较好的消毒效果。 有时还可以用磁力搅拌、超声振动等方法使消毒杀菌剂进入外植体。消毒溶液对外植体消毒是在超 净工作台上进行。完成表面消毒的接种材料要尽快放置于培养基中。 三、器材 1．试剂：硝酸胺，硝酸钾，磷酸二氢钠，硫酸镁，氯化钙，硫酸铁，乙二胺四乙酸，2，4 -D , BA lmol/L 盐酸，lmol/L氢氧化钠、0.1％氯化汞（剧毒!）, 75％乙醇无菌水，无菌培养皿，MS 培 养基。 2 ．器具：电子天平，冰箱，pH 试纸，烧杯，量筒，试剂瓶，三角瓶，吸耳球，刻度吸管，洗 瓶、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、各种接种工具、无菌纸、一次性手套、酒精灯、标签纸、记