粉蕉ACC氧化酶cDNA的克隆及其序列分析研究.pdfVIP

82 中国园艺学会热带南亚热带果树分会成立大会暨首届学术研讨会论文集 粉蕉ACC氧化酶cDNA的克隆及其序列分析 黄永红， 易干军木， 周碧容，曾继吾，吴元立 (广东省农业科学院果树所广州510640) 方法从成熟香蕉果实中克隆到一条香蕉ACO基因全序列，经分析发现，该氧化酶cDNA物全长1172bp， 基因编码区共957bp，推测其编码318个氨基酸。Blasm结果显示，该基因与己报道的香蕉ACO基因核 苷酸序列同源性为95％以上，与其它作物的ACO基因核苷酸序列同源性高达70％～98％；该基因推导的 氨基酸序列与其它12中果树的ACO基因编码的氨基酸序列同源性在68％～98％，并且有九个较长的保 守结构域。聚类分析结果表明，该基因推导的氨基酸首先与生长环境相似的呼吸跃变型果实聚合。 关键词：香蕉；ACo；序列分析；克隆 乙烯是一种结构简单、功能多样的植物激素，它在植物的整个生长发育(包括种子萌发、花开花谢、 实成熟、衰老、器官脱落及胁迫反应等)过程中都起调控作用”捌。ACC氧化酶(ACO)是植物体内乙烯 生物合成的限速酶，通过抑制这两种酶的活性可以抑制乙烯的产生，延迟呼吸高峰的到来，从而可以 达到延迟成熟、保鲜和耐贮藏的目的。现已从苹果口1、桃嗍、猕猴桃p1和哈蜜瓜嘲等果实中克隆了ACC 氧化酶基因。香蕉是一种典型的呼吸跃变型果实，达到生理成熟采收后很快出现呼吸高峰，果肉迅速 变软，商品性和贮运性大大降低。贮运期间发生的果实腐烂常常使香蕉种植者和经营者蒙受巨大经济 损失，从而影响了整个香蕉产业的发展。利用香蕉ACO反义基因转化香蕉优良以培育耐贮藏的香蕉新 品种并进行香蕉采后的分子生物学研究，是推动香蕉产业更快更优发展的一条重要途径，具有很大的 为研究材料进行克隆，其它基因型的ACO基因很少报道，ABB基因型的粉蕉没有报道。本研究利用 香蕉中的一个粉蕉类型(ABB)为材料，克隆ACO基因全序列并对其进行序列分析，将两种不同类型 的香蕉ACO基因进行对比分析，并将其与其它12种重要果实ACO基因进行对比分析，以便更全面了 解香蕉ACO基因，为通过ACO基因调节香蕉内源乙烯，以延长香蕉货架期奠定理论基础。 l材料与方法 1．1材料 香蕉品种粉蕉(ABB)采自广东省农业科学院果树所香蕉国家资源圃。 1．2方法 1．2．1引物合成与设计 作者简介：黄永红，硕士，主要从事基因工程方面的研究，Tel一020E·mail：gstshh@126．tom for +通讯作者．Author correspondence．020E-mail：Yiganjun@vip．163．tom 中国园艺学会热带南亚热带果树分会成立大会暨首届学术研讨会论文集 83 引物由上海生工公司合成。 1．2．2果实总RNA提取 成熟香蕉果实总RNA的提取参照冯斗川的方法进行。 1．2-3RT—PCR 司)，42。C1h，进行反转录合成。以获得的反转录产物为模板，进行特异合成引物的PCR扩增。反应 糖电泳检查PCR产物。 1．2．4扩增产物的克隆及重组克隆的筛选 vector 用回收试剂盒(天为时代公司)回收PCR产物。按照DNA kit(上海生工公司)说 cloing 明，建立10 pL连接反应体系，将PCR产物与克隆载体pUCm—T连接。连接反应产物转化感受态大肠 杆菌E．CohDH5 Ot，并涂布于含有X—Gal、IPTG的LB固体培养基(附加100mg／LAmp)上、于37。C培 养8。12h。 1．2．5测序与数据分析 蓝白斑筛选后，挑取阳性克隆送上海生工测序部进行测序。将测得的序列在NCBI上进行Blastn 进行同源性比较分析，并用DNAman软件进行氨基酸的系统树分析和保守结构域分析。 2 结果与分析 2．1 RNA提取 倍，说明提取的样品中RNA没有发生降解，完整性好。用分光光度计检测 组质粒pUCm—ACO的获得用所提取的RNA为模板做RT—PCR， 结果