总RNA的提取和RT-PCR..ppt

溴化乙锭(EB) :3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，可与DNA结合,在紫外光照射下呈现红橙荧光,有致癌性. Gelview: 是一种新型核酸染料,可与DNA分子形成复合物，能产生极强的荧光信号，其灵敏度比EB高, 且荧光强度与DNA含量成正比荧光,在紫外光照射下呈现绿色荧光. 常用染料 实验材料 含有分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。 应选择在目标片段大小附近ladder较密的marker，这样对目标片段大小的估计较准确。 DNA Marker 实验材料 凝胶准备 胶床准备 铺胶 静置 胶床置于电泳槽中 加电泳缓冲液 拔梳子 上样 电泳 取出凝胶 拍照 实验步骤 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃，否则温度太高会使制板变形 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔 电泳前，确认样品孔位于电场负极； 点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多 Gelview有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔 紫外线照射不要太久 注意事项 思考题 RNA降解的主要原因以及预防措施？ 逆转录与中心法则的关系？ PCR非特性扩增的原因？ 实 验 总RNA的提取与RT-PCR 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 /sfzx/ 完整RNA的提取和纯化,是进行RNA 方面的研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。 掌握从细胞中提取总RNA的方法 掌握RT-PCR基因扩增的原理和操作方法 目 的 实 验 流 程 提取原理 操作步骤 逆转录原理 操作步骤 提 取 总RNA 合成cDNA 第一链 原理体系 引物选择 PCR 电泳原理 电泳步骤 电 泳 第一部分 细胞总RNA的提取 操作步骤 1.匀浆化作用 8000rpm 离心2min收集细胞，弃上清；加入500uL的TRIpure,用振荡器震荡至无明显沉淀,室温静置5min. 2. 分离阶段 向匀浆样品中加入0.1mL氯仿，剧烈震荡15s，室温下孵育2-3min，12000g离心15min，吸取上清至新Ep管。 3. RNA的沉淀 向上清中加入0.5mL异丙醇，上下颠倒混匀,室温孵育10min， 12000g离心10min，弃去上清液，可见胶状沉淀。 4. RNA的漂洗 加500微升75％乙醇洗涤沉淀一次，轻轻上下颠倒洗涤， 12000g离心5min,弃去乙醇. 5. RNA的再溶解 空气干燥RNA沉淀，注意不要完全干燥，加入10uL RNase-Free处理水，充分溶解。 原 理 10-5mg RNA/细胞 mRNA 3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA) 结构，可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。 目前常用的是Trizol法。 rRNA 80-85%：28S 18S 5S tRNA, snRNA 10-15% mRNA 1-5% 原 理：Trizol的主要成分 Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂 主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。 酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。 在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相中。 取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 原 理 仪器和主要试剂 1. 微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管 2. TRIpure试剂 3. 氯仿 4. 异丙醇 5. 75℅乙醇 6. 无RNase的水(溶液均需用DEPC处理过的水配制) 所有ＲＮＡ的提取过程中都有五个关键点： 样品细胞或组织的有效破碎； 有效地使核蛋白复合体变性； 对内源ＲＮＡ酶的有效抑制； 有效地将ＲＮＡ从ＤＮＡ和蛋白混合物中分离； 对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。 关 键 点 RNA酶污染来源 RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。 严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染。 最大限度地抑制内源性的RNA酶：而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。 防止RNA