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第三节 负染色技术p142 又称为阴性反差染色。 原理： ·密度反差原理——某样品如果被密度比自身大2倍以上的物体浸没时，电镜下就形成强反差像 ·异常反差原理——由于静电场作用所形成的反差 特点：提高了标本的反差和分辨率 简便易行，不要求高纯度的样品 染色本身不改变生物标本的活性 应 用·大分子·细菌·病毒·原生动物·亚细胞碎片·分离的细胞器·蛋白质晶体的形状、大小及表面结构等特征 负染色技术常用染液 染液为重金属盐类，常用的有： ·1%~3%的磷钨酸钾、磷钨酸钠（ pH6.4~7.0 ） ·0.1%~1%的醋酸铀水溶液（ pH4.5） 常用方法： 现将要观察的生物样品制成适当浓度的悬液（105/ml），滴一滴在覆有Formvar膜或碳膜的铜网上，沉淀5~10min后用滤纸吸去多余液体。在铜网上液滴将干未干时将染色剂滴在铜网上，染色5~10min，滤纸吸干观察。 避免——标本凝集现象 生物标本凝集成团的原因：可能是由于标本表面张力、标本带电荷、支持膜的“疏水”作用及其制备的标本的质量、悬液的酸碱度等问题 解决办法：采用分散剂（BSA） 具体：在0.5ml样品内加入3~4滴0.005%~0.05%牛血清白蛋白（BSA），或直接用0.01% BSA作为离心沉淀物的稀释剂 甲型流感病毒，多形态性（园，椭圆，丝状体），外膜有放射状排列的纤突 第四节 电镜酶细胞化学技术p103 目前电镜下能定位的酶还不到100种，而且只能作定性观察，即通过酶的活性间接证明酶的存在。 原理：先将酶原位固定在细胞内，再使它与特定底物起反应，底物的分解物经过捕捉反应沉着于发生分解的原位上，最后使沉着物变为电镜下可以见到的物质。 电镜下能定位的酶：水解酶、氧化酶、转移酶（应用少） 1. 水解酶 水解酶：磷酸酶类，酯酶类，芳香基硫酸酯酶，糖苷酶，作用于肽键的酶 孵育液：酶的反应底物捕捉剂（重金属类，如铅、铜、钡、铈等） ·反应基本原理： 底物 初级反应产物 最终反应产物 酶 捕捉剂 （多为不溶性金属沉淀物） 2. 氧化酶 氧化酶 H2O2 H2O nDAB DAB 锇黑（高电子密度） 氧化聚合物 OsO4 3. 脱氢酶 琥珀酸脱氢酶 琥珀酸 延胡索酸酶 铁氰化物 亚铁氰化物 亚铁氰化铜沉淀 Cu2+ 酶细胞化学的常规操作 取材 固定（低浓度的戊二醛） 置换缓冲液（建立适宜的pH条件） 孵育（新鲜配制的孵育液） 漂洗组织（去除剩余试剂，特别是铅离子） 后固定（1%四氧化锇） 脱水包埋（同常规，脱水时间缩短） 超薄切片与染色 对照实验（去除特异性反应） 酶及其在细胞内的定位部位 酸性磷酸酶——溶酶体，高尔基 碱性磷酸酶——细胞膜 葡萄糖-6-磷酸酶——内质网，核膜 乙酰胆碱酯酶——神经细胞的内质网，核膜，突出间隙 琥珀酸脱氢酶——线粒体内膜和嵴 细胞色素氧化酶——线粒体膜和嵴 焦磷酸硫胺素酶——高尔基体 腺苷三磷酸酶——分解ATP，耗能部位 髓过氧化物酶——粒细胞和单核细胞的内质网、核膜、高尔基体和胞质颗粒中 血小板过氧化物酶——巨黑包的内质网及血小板致密管道系统 第五节 电镜免疫细胞化学技术p110 免疫电镜（immunoelectron microscopy,IEM）技术使利用抗原与抗体特异性结合的原理，在超微结构水平上定位、定性及半定量显示抗原的技术方法。 为研究细胞结构与功能的关系及其在病理情况下所发生的变化提供了有效的手段 分为：免疫凝集电镜技术，免疫电镜定位技术 免疫电镜技术的三个发展阶段： 1959年 铁蛋白标记技术 1968年 酶标记技术 1970′s 胶体金标记技术 1. 铁蛋白标记技术 铁蛋白分子质量大，电子密度高，适用于定位细胞膜表面抗原。 第四章 透射电镜的其他制样技术 冷冻超薄切片技术 冷冻蚀刻技术 负染色技术 电镜酶细胞化学技术 电镜免疫细胞化学技术 电镜放射自显影技术 电镜X射线微区分析制样技术 第一节 冷冻超薄切片技术p172 冷冻超薄切片技术是将组织从活体取下后，经过简单的固定或不固定就直接冷冻，并在冷冻的条件下进行超薄切片的技术。 冰冻超薄切片流程 固定（低浓度戊二醛，短时间固定） 明胶“包埋”（明胶或甲基纤维素、醛交联的牛血清白蛋白，此步可省略） 冷冻保护处理（甘油、蔗糖、二甲基亚砜） 超低温快速冷冻（液氮直接冷冻，借助金属材料，使