五 核酸杂交 w.ppt

（二）常用的非放射性标记 方法：1.酶标记法 2.化学标记法 优点：无环境污染，可较长时间贮存 要求：标记物应具有耐热、对组织细胞无特异亲和性、分子量小，对探针杂交无影响或影响甚小，不影响DNA三维空间构象的形成。 常用的标记物：生物素（biotin）、地高辛（digoxigenin）、光生物素（photobiotin）、补骨脂素、2-乙酰氨基芴（2-acetylomino fluorene） 1. 生物素标记核酸探针 Bio-lldUTP、Bio-7dATP、Bio-11-dCTP、Bio-16-dUTP等。 2. 地高辛（Dig）标记核酸探针 * * 核酸分子杂交技术 遗传学与分子生物学系 李信民 5372009443@ 核酸分子杂交（nucleic acid hybridization） 指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。 不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下重新组成的新的双链分子——杂交分子。 第一节 核酸杂交的基本理论一、变性与复性  DNA的变性(denaturation)： 在某些理化因素作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。 解链温度（融解温度，Tm）(melting temperature)： 使50%的DNA发生变性时的环境温度。 DNA的变性从开始解链到完全解链是在一个相当窄的温度内完成的。 1. 常用的变性方法： ① 热变性 ② 酸碱变性 ③ 化学试剂变性 2. 影响复性的因素 ① 序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA)识别快 ② DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢 ③ 离子强度↑→有利于复性 ④ DNA浓度↑→复性↑ Tm值的估算 ① 20bp Tm=4（G+C）+2（A+T） ② 20bp Tm=69.3+0.41(G+C)% 核酸杂交：不同来源的两条核酸单链由于具有互补序列，在一起复性时，互补序列配对，形成杂化分子。 + 二、影响杂交的因素 1. 核酸分子的浓度和长度 2. 温度：比Tm低25℃~30℃较适宜 3. 离子强度：离子强度↑→杂交反应率↑ 4. 杂交液中的甲酰胺 甲酰胺能降低核酸杂交的Tm， 含30%—50%甲酰胺的杂交溶液温度能降低到30—42℃。 使用甲酰胺的优点： ①低温下探针更稳定； ②能更好地保留非共价结合的核酸。 5. 核酸分子的复杂性直接影响复性几率。 6. 非特异性杂交反应：在杂交前将非特异性位点进行封闭，以减少对探针的非特异性吸附作用。 常用封闭物： ①变性非特异DNA：鲑鱼精子DNA， 小牛胸腺DNA ②高分子化合物：Denhardt溶液 脱脂奶粉 第二节 核酸探针 一、探针的选择原则 1. 高度的特异性 2. 制备探针的难易性和检测手段的灵敏性 二、探针的种类 1. 基因组DNA探针 从基因组DNA文库中选取某一基因片段 ↓ 与载体连接（质粒、噬菌体） ↓ 克隆(PCR扩增) ↓ 酶切 优点：①无性繁殖、制备方法简单；②不易降解（与RNA比较）；③标记方法成熟。 2. cDNA探针（complementary DNA） ↓S1核酸酶切平两端 优点： 不含内含子及高度 重复序列但不易获得 ↓ 载体连接 ↓ 克隆 通过逆转录 ↓ 双链cDNA 加接头 ↓限制酶 粘性末端 3. RNA探针：检测DNA和mRNA 优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性 杂交较少,未杂交探针可用RNase 降解，减少本底的干扰。 缺点：易降解，标记方法复杂 4. 寡核苷酸探针 优点：①可根据需要合成相应序列； ②探针短,序列复杂性低,分子量小， 因此杂交时间短; ③长 度只有10—50b，该识别序 列内1个碱基的变化可明显降低杂 交Tm值。 ④可大量合成，价格低，能够用酶 学或 化学方法进行非放射性标记。 三、探针设计原则： ①长度：10~50b ②碱基成分:G+C含量为40%~60% ③探针分子内无互补序列。 ④避免同一碱基重复出现。 ⑤ 一旦选定某一序列后，尚需与已知的各种基因序列进行同源性比较，与