基于代谢流平衡模型的L谷氨酰胺生物合成机理分析研究.pdf

基于代谢流平衡模型的 L一谷氨酰胺生物合成机理分析 马 雷 陈 宁 (天津科技大学天津300222) 徐国华 (山东福瑞集团公司 山东莒南) 代谢流分析(帆～)是代谢工程中用以指导遗传操作的重要工作，是代谢网 络分析的基本方法。MFA围绕胞内代谢反应，使用物料衡算方法，对所有主要的 胞内反应建立一个基于化学计量的代谢流平衡模型(MFB)，并利用该模型计算 不同途径的代谢流分布。通过分析可以确定胞内途径的刚性节点为及存在的不 同分支选径；计算胞内未知通量；验证其他代谢途径对代谢网络通量分布的影 响；计算最大理论转化率。这对于代谢工程的遗传改造工作和发酵控制具有很 大的指导意义。本文通过建立谷氨酸生物合成的代谢流平衡模型，对代谢网络 进行了定量分析和网络优化分析，并计算出谷氨酸分批发酵中后期的代谢流分 布，以期对谷氨酰胺产生菌的遗传操作和发酵控制提供指导。 1材料和方法 天津科技大学代谢控制发酵研究室保藏菌种。 1．2分析方法 1．2．1发酵液中残糖测定：采用SBA-40系列生物传感分析仪测定。 1．2．2 定。 1．2．3发酵液中氨基酸含量测定：采用日立氨基酸分析仪测定。 2天津短杆菌合成L广谷氨酰胺的代谢流平衡模型的建立 2．1代谢流计算 MFA以拟稳态假设为基础：假设细胞内的中间代谢物均处于拟稳态，即其浓 度变化速率为0。本文采用Joseph · 102· 物的积累速率，有 (1) ri(t)=∑ajxj(t)一]akXk(t) 式中，xj(t)：第j步反应的反应速率(mmol／L·h) )【Ic(t)：第k步反应的反应速率(mmol／L·h) ai：第j步反应的反应计量系数，al【：第k步反应的反应计量系数 ri(t)：中间代谢物i的积累速率(mmol／L·h) 由拟稳态假定可得ri(t)=0。代谢网络中的m个中间代谢物构成m个代谢 流平衡方程式，写成矩阵形式为： Ax(t)=0(2) 式中，A： m×n维矩阵，x(t)：n×1维矩阵，n：选定的速率总数目。这样 由m个中间代谢物即可得到m个关于速率的约束条件，待解问题的自由度为：F =n—m，通过实验测出F个不相关速率即可确定胞内整体流量分布，从而对其生 理行为进行定量的描述。 2．2代谢网络的建立 与大肠杆菌不同的是，谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌等微生物中天冬氨酸激酶 是单一的，并且受赖氨酸和劳氨酸的协同反馈抑制，反馈调节易于解除，使育种 过程简单化，故常被用作氨基酸发酵育种的出发菌株[4】。 的各种酶也存在，如PPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)、PC(丙酮酸羧化酶)、以及 J．VaUino的研究表明谷氨酸棒杆菌在以葡萄 乙醛酸循环的各种酶，但是Joseph 糖或葡萄糖加醋酸为底物的培养基中培养，乙醛酸支路并未出现，这说明TCA 循环仍是谷氨酸菌属发酵过程中的主要氧化途径；研究还表明，在上述培养基 主要回补反应。 由于菌体生长过程中代谢网络复杂，同时我们的主要考察对象为氨基酸的 合成，因此本文中将不考虑细胞生长代谢。 根据以上分析，综合各种文献资料，本文基于以下原则建立代谢网络：1．细 胞处于非生长时期或细胞浓度变化不大可以忽略；2．细胞代谢过程中不存在乙 循环产生的NADPH总数相等；4．在细胞生长不旺盛阶段，由于大量无效循环的 存在，ATP的消耗量和细胞维持能总量并不相等，因此本文不考虑ATP总量的平 · 103· 衡；5．按照固定比例进行的反应以及无分支点的中间反应，简化为一个反应方 程。 2．3代谢流平衡模型的建立 根据以上代谢网络以及各步反应的化学计量平衡式(见附录)，各反应速率 具有如下计量关系： G6P：rl—