第三节 外源基因在真核细胞中的表达.pptVIP

生命科学学院 1. 载体的3 AOX1区与基因组的AOX1基因的末端发生整合重组 表达载体与甲醇酵母基因组发生重组的方式： 2. 载体的HIS4区与基因组的HIS4基因的末端发生整合重组 利用甲醇酵母表达系统进行NGAL蛋白外源表达进行验证的实验技术路线： 构建表达载体→转化至酵母菌中→筛选阳性转化单克隆→筛选高表达单克隆 挑单克隆于培养液 振荡培养3～5天，加甲醇诱导目的蛋白的表达 离心 酵母上清 第三节 外源基因在真核细胞中的表达 甲醇酵母表达系统的优点 强启动子 可进行翻译后加工 营养要求低 可高密度发酵 表达高 表达的蛋白质可胞内也可胞外 糖基化程度低 甲醇酵母表达外源蛋白示例 第三节 外源基因在真核细胞中的表达 影响目的基因在酵母菌中表达的因素 ⑴ 外源基因的拷贝数 ⑵ 外源基因的表达效率 　 ① 启动子 ② 分泌信号的效率 ③ 终止序列的影响 ⑶ 外源蛋白的糖基化 ⑷ 宿主菌株的影响 　 ① 菌体生长力强 ② 菌体内源蛋白酶要较弱 　 ③ 菌体性能稳定 ④ 分泌能力强 第三节 外源基因在真核细胞中的表达 在酵母中高效表达的策略 选择合适的受体细胞系统 提高表达载体在细胞中的拷贝数 提高外源基因转录水平 第三节 外源基因在真核细胞中的表达 三、真核表达的受体系统 2.昆虫表达系统 　　　昆虫表达系统是一类应用广泛的真核表达系统,它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰、加工以及转移外源蛋白的能力。 　 利用重组杆状病毒在昆虫细胞系中表达外源蛋白是目前较为流行的表达系统； 另一类新型的昆虫细胞表达系统,则是建立在对果蝇等昆虫细胞进行稳定转化的基础之上的,在稳定性和表达效率方面有着更为突出的优点。 第三节 真核细胞表达系统概述 三、真核表达的受体系统 2.昆虫表达系统 　　昆虫表达系统的缺点 　　　1. 载体大量复制，最终导致宿主细胞或幼虫死亡，不能连续生产外源蛋白。 　　　2. 昆虫细胞对蛋白产物的糖基化方式与哺乳动物有所差异，可能影响到产物蛋白的活性和免疫原性。 　　　3. 昆虫细胞的大规模培养费用大。 第三节 真核细胞表达系统概述 　三、真核表达的受体系统 3、哺乳动物细胞表达系统 　　　哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的糖基化和准确的糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。 　根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分为瞬时、稳定和诱导表达系统。 第三节 真核细胞表达系统概述 　三、真核表达的受体系统 4.植物表达系统 　　　以植物个体、果实或器官作为生物反应器,将目标基因与植物病毒或特定的植物调控元件构建融合基因,以此制造转基因植物,目标基因将在预定时期和部位表达。该系统在启动期需较大资金投入,一旦获得预期的转基因植株,便可以极低的成本进行大规模的生产。其缺憾为产物的翻译后修饰与动物有些不同,这限制了其应用范围。美国一家公司已用转基因香蕉生产出了疫苗。 第三节 真核细胞表达系统概述 　四、优化外源基因在真核细胞中表达的策略 1.转录水平的优化 （1）选择合适的启动子 （2）正确利用增强子 （3）正确使用内含子 　　　 第三节 真核细胞表达系统概述 　四、优化外源基因在真核细胞中表达的策略 2.翻译水平的优化 （1）添加5’UTR 和3’UTR （2）优化起始密码周边序列 （3）对基因编码区加以改造 　　　 第三节 真核细胞表达系统概述 　四、优化外源基因在真核细胞中表达的策略 3.防止外源基因的失活 （1）连接核基质结合区，减少位置效应 （2）转移完整功能域，提高基因表达 4. 多基因策略　　　 第三节 外源基因在真核细胞中的表达 主要基因工程表达体系比较 表达体系 产 物 产生部位 培养方式 提 纯 产物活性 潜在危性 大肠杆菌 多肽蛋白质 菌体内 容易 一般 对原核好 不大 融合蛋白质 部分高产 对真核差 酵 母 多肽蛋白质 菌体内 容易 菌体内 真核的接近 不大 糖基化蛋白 外分泌