生物技术系细胞生物实验手册 - Untitled.pdfVIP

前 言 这本实验教材是为生物科学与生物技术专业的细胞生物学教学而编 写，适用于该专业五年制本科等学生使用。 细胞生物学实验课的教学目的，主要是通过基本技能训练及观察分析 实验结果，使学生了解掌握有关的实验技术原理和操作方法，进而提高学 生动手实践、观察分析和解决问题的能力。基于生物技术专业的学生已完 成基本的实验操作训练，本套实验内容自成体系，着眼于提高学生的专业 技能训练，及观察分析问题和科学思维能力的培养。全部实验采用活细胞 为材料，由学生自己动手取材和实验，使学生能对细胞获得主动的认识， 选编了生物医学常用的细胞生物学科研技术，如细胞的原代和传代培养、 细胞的冻存与复苏、细胞凋亡的实验观察、基因表达载体的构建、基因的 表达与定位检测等，为学生日后的实际科研工作打下基础。 全书内容共六个实验，分三次授课，共计24学时，与理论课授课内容 相辅相成，互为补充。所有实验由学生自己动手操作，少数应用大型精密 仪器的内容进行示教。 本教材由细胞生物教研室方瑾、邵阳光、张惠丹、李想、刘芙蓉等教 师及教辅人员参与编写，均具有丰富的理论和实验课教学经验。由于经验 不足，本教材还有很多亟需改进之处，敬请使用者批评指正。 中国医科大学 细胞生物教研室 2006年9月 目 录 实验一 培养细胞的形态观察和计数……………………………………1 实验二 细胞的冻存与复苏………………………………………………5 实验三 细胞的原代和传代培养…………………………………………7 实验四 放线菌素D诱导HL-60细胞凋亡的实验观察……………… 11 实验五 含有目的基因真核表达pEGFP-C1载体的构建………………15 实验六 目的基因在真核系统中的表达及细胞内的定位………………24 实验一 培养细胞的形态观察和计数 实实验验一一 培培养养细细胞胞的的形形态态观观察察和和计计数数 【实验目的】 1.了解培养中的动物细胞的一般形态和生长状态 2.掌握细胞计数的基本方法 【实验用品】 1.材料和标本 培养中HeLa 细胞、NIH3T3、HL60细胞 ２.器材和仪器 倒置显微镜、细胞计数板、普通光学显微镜、乳头吸管、盖片 ３.试剂 0.3％台盼兰染液、0.25％胰蛋白酶－0.02％EDTA混合消化液 【实验原理】 体外培养的细胞主要有两种状态。一种是能贴附在培养支持物上的细 胞，如HeLa细胞、NIH3T3等，叫贴壁型细胞，体外培养的细胞大多属于 这种细胞。另一种细胞并不贴附在容器的壁上，而是悬浮在培养液中生长， 如HL60细胞，叫做悬浮型细胞，这类细胞主要是血液原性或癌原性细胞。 在细胞生物学的实验中，往往要进行活细胞的鉴定和 细胞的计数、调整细胞的密度，是进行实验不可缺少的 一种基本技能。 【实验内容】 一 培养细胞形态观察 1.将细胞培养瓶从37ºC二氧化碳培养箱（或温箱）中取出，瓶口稍稍向上 倾斜以免瓶内液体接触瓶塞或流出瓶口，注意观察细胞培养液的颜色和清 澈度。然后，将细胞培养瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上。 2.打开倒置镜光源，用10X物镜观察，通过双筒目镜将视野调到合适的亮 度，并调节双目镜的光瞳间距，使左右两个视场象合而为一。 3.调节载物台高度进行对焦，在看到细胞层之后，用细调节器将物像调清 楚，注意观察细胞的轮廓、形状和内部结构。在观察时，经常使用的是十 倍的物镜。 4.结果 贴壁细胞一般有两种形态，即上皮细胞型和成纤维细胞型细胞。上皮细 胞型细胞呈扁平的不规则多角形，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连 接成单层细胞片，如HeLa 细胞。成纤维细胞型细胞形态与体内成纤维细 胞形态相似，胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质向外伸 出2～3个长短不同的突起，细胞群常借原生质突连接成网，细胞生长时多 呈放射状或漩涡状，如NIH3T3。 贴壁细胞在生长状态良好时，细胞均质而透明，细胞内颗粒少，看不 到空泡，细胞边缘清楚，培养基内看不到悬浮的细胞和碎片，培